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人树突状细胞cDNA质粒文库的构建及其大规模随机测序体系的建立①
中国免疫学杂志 1999年第6期第15卷 分子与细胞免疫学
作者：章卫平 曹雪涛 万 涛 朱学军 袁正隆 何 龙
单位：第二军医大学免疫学教研室，上海200433
关键词：树突状细胞；cDNA文库；大规模测序；免疫分子；基因克隆
摘 要 目的：建立人树突状细胞(DC)的cDNA文库，通过大规模随机测序克隆免疫新分子。方法：来源于正常人外周血的单核细胞，体外经GM-CSF和IL-4培养，扩增出高纯度的DC，抽提纯化mRNA，转录成cDNA，定向插入pSPORT2.0载体，建立人DC的cDNA质粒文库；用ABI377全自动测序仪对该文库进行随机测序，将得到的EST在Sun-E450服务器中与EMBL及Swissprot数据库进行同源性比较，筛选出代表未知基因EST，然后在GCG软件中进行分析，对重要的未知EST克隆其全长cDNA。结果：所扩增的DC经流式细胞仪分析高表达MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、B7、CDla和CD83等表面标志，能强烈刺激同种异体T淋巴细胞的体外增殖反应；建立的DC cDNA文库92%以上克隆有平均1.6 kb大小的插入片段；从所测的12 000余条EST中筛选出代表未知基因的3 000余条，克隆到109条全长新基因，包括属于细胞因子、细胞因子受体、趋化因子和粘附分子等家族的免疫新分子，部分全长基因已在Genebank中登录。结论：成功建立了人DC的cDNA基因文库及其大规模随机测序体系，并克隆到免疫分子。
Establishment of large scale sequencing system for the cDNA library of
human dendritic cells
ZHANG Wei-Ping, CAO Xue-Tao, WAN Tao et al.
Department of Immunology, Second Military Medical University, Shanghai 200433
Abstract Objective： To construct cDNA plasmid library of human dendritic cells (DC) and establish large-scale sequencing system for new molecule identification.Methods:The peripheral blood monocytes from normal adults were cultured in the presence of GM-CSF and IL-4 to generate highly purified human DC.DC were characterized by FACS analysis and MLR, and subjected to RNA extraction and poly(A)+RNA purification. The cDNA library was constructed by inserting the transcripted cDNA from human DC into pSPORT2.0 vector and identified by restrictive cleavage. The random clones from human DC library were picked for large scale sequencing by ABI377 automated sequencers to create our database of expressed sequence tags (ESTs), which were analyzed and processed by bioinformatic tools.Results:Monocyte-derived DC express high levels of CDla, CD83, MHC-Ⅰ, MHC-Ⅱ, CD40 and B7-1, and stimulate the proliferation of allogeneic T cells potently. More than 92% random clones from DC cDNA library have inserts averaging 1.6 kb. Among 12 000 currently available ESTs, 4.3% was identified to be functionally immune-related, and 25% represented unknown genes. Up to now, 109 full length cDNA were successfully identified, including some novel immune molecules such as cytokines, cytokine receptors, chemokines and adherent molecules,the immune functions of which are under further investigation.Conclusion:The system for large scale sequencing of human DC cDNA library was successfully established and demonstrated as efficient approach to new molecule identification.
Key words Dendritic cells cDNA library Large scale sequencing Immune molecules Gene cloning
中国图书分类号 R392.2
人类基因组计划(Human Genomic Projects, HGP)是生命科学领域的一项跨世纪工程，目的在于获得人类的全部基因组信息，揭示人类生命的奥秘及疾病的发生发展规律，最终探索出战胜疾病的方法。随着分子生物学和计算机技术、生物信息学的发展，大规模测序已成为揭示细胞基因表达谱和发现新分子的有效手段［1，2］。树突状细胞(Dendritic cells, DC)是一类重要的专职抗原提呈细胞(APC)，来源于髓系和淋巴系，可能存在不同的细胞亚群，不同来源及不同亚群的DC在机体免疫应答中可能发挥不同的作用。近年来，树突状细胞的分化发育、抗原加工提呈机理及其在肿瘤、感染、自身免疫性疾病和移植排斥中的作用已经成为免疫学的前沿领域和研究热点［3，4］。为深入认识DC的生物学功能，阐明其生物学作用的分子机理，我们在以往DC研究工作的基础之上［5-8］，建立了人DC cDNA基因文库的大规模随机测序体系，以期从DC中寻找和发现具有我国自己知识产权的免疫新分子。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 rhGM-CSF、rhIL-4和人淋巴细胞分离液(Histopaque-1077)购自Sigma公司，FITC荧光标记的抗人HLA-A，B，C、HLA-DR、CD1a、CD40、CD14和B7-1单克隆抗体购自PharMingen公司，PE荧光标记的抗人CD83单抗购自Immunotech公司，cDNA质粒文库构建试剂盒购自Gibco公司，生物素亲和素磁珠mRNA纯化试剂盒(Boehringer), BigDye terminator四色荧光测序试剂盒购自Perkin-Elmer公司。
1.2 主要设备及软件 PCR9600、ABI377 DNA全自动测序仪及其数据采集软件Data Collection和分析软件Sequencing Analysis 3.0(Perkin-Elmer)、Sun-E450服务器及其操作系统Solaris2.6(Sun)，BLAST分析采用Wu-BLAST2.0软件(用Sun公司的Sunpro C语文编译)，所用核酸和蛋白数据库分别为EMBL(55.0，56.0，57.0)和Swissprot(36.0)，基因及蛋白分析软件为Wisconsin Package 10.0 (GCG)和Autostrider 1.2。
1.3 人树突状细胞(DC)的培养扩增 取正常成人外周血，经人淋巴细胞分离(Histopaque-1077)密度梯度离心分离单个核细胞，经无Ca2+、Mg2+的PBS洗两次后悬于RPMI1640完全培养基，置37℃、5%CO2培养2 h，弃上清，用预热的培养基洗去非贴壁细胞，然后加入含rhGM-CSF 100 ng/ml、rhIL-4 500 U/ml、10%胎牛血清的RPMI1640完全培养基，收集培养第7天的悬浮细胞即为DC［8］，进行DC表型和功能鉴定，用于文库构建。
1.4 人DC细胞表型的FACS检测 5×105细胞悬于FACS标记液PBA(100 μl/管)中，加入100 μl荧光标记抗体(0.5 μg)，于4℃孵育30 min，PBA洗两遍后悬于PBA中，用流式细胞仪FACScalibar及其分析软件CELLQuest检测分析。
1.5 同种异体T淋巴细胞增殖反应 分离正常人外周血单个核细胞，置37℃培养2 h后去除贴壁细胞，非贴壁细胞用5%人AB型血清的RPMI1640完全培养液悬浮，过尼龙毛柱(37℃孵育1 h)，制备的T淋巴细胞加入96孔板(每孔2×105)。DC经丝裂霉素(25 μg/ml)于37℃处理1 h后，悬于含10%人AB血清的完全培养基，按不同剂量(每孔1×103～1×105)加入96孔板中与同种异体T淋巴细胞混合，每组设3个复孔，终体积为200 μl。置37℃、5%CO2培养96 h，于结束前16 h加入3H-TdR(0.5 μCi/孔)，收集细胞，β计数仪检测cpm值。
1.6 mRNA的抽提及人DC质粒文库的构建 用Trizol(Gibco)提取DC(2×107)细胞总RNA，用生物素标记的Oligo-dT和亲和素标记的磁珠(Boehringer)纯化PolyA+RNA。取4 μg PolyA+RNA，以NotI-OligodT为引物，在Superscript Ⅱ反转录酶的作用下合成cDNA第一链，第二链合成后经T4 DNA聚合酶补平，连接上SalⅠ适配子、经NotI酶切，用Sepharose 400分离柱去除500 bp以下小片段，然后将产物定向克隆至pSPORT2.0载体的Sa1I/NotI位点；连接反应产物经乙醇沉淀后溶于水，经电穿孔转化大肠杆菌DH10B。原始文库经半固体培养基培养扩增后置-70℃保存。随机挑取菌落，小量制备质粒DNA，用SalI/NotI酶切鉴定重组子插入cDNA片段的大小。
1.7 人DC文库的大规模随机测序 随机挑取DC文库的单个菌落，接种于96孔细菌培养板(Qiagen)，37℃振荡培养过夜，离心收集菌体制备模板，对克隆的5′端进行大规模测序筛选；根据Sanger双脱氧链终止法原理、用BigDye Terminator测序反应试剂盒在PCR 9600扩增仪(Perkin-Elmer)上进行测序反应，反应产物经纯化后溶于甲酰胺-EDTA/蓝色右旋糖苷；在ABI377全自动测序仪上行5%聚丙烯酰胺凝胶(36 cm)电泳(51℃，7 h)，用Data Collection软件采集原始胶图数据，经Sequencing Analysis 3.0读出碱基序列。
1.8 数据分析 原始的碱基序列经自行编制的软件去除载体序列及模糊序列后得到相应克隆的EST(Expressed sequence tag)序列，经以太网传至Sun-E450服务器中进行分析，分析流程见图1。首先将EST添加入我们自己的DC数据库(DCDB)，通过与已有的非冗余数据库(NRDB)的BLASTN比较，筛选到非冗余EST，进一步与EMBL数据库进行BLASTN分析，将与已知基因同源超过95%、同源片段长度超过100 bp的序列归为已知基因，同源性较低或同源片段小于100 bp的归为未知基因。非冗余EST根据分类存入NRDB数据库；未知基因的EST进一步用BLASTX分析其可能的编码蛋白，用GCG软件包对可能的编码蛋白进行基序(motif)搜寻、功能结构域分析以及蛋白质二级结构及相关理化性质的预测。对非全长克隆，根据分析结果确定是否克隆其全长cDNA。
图1 大规模测序数据处理流程
Fig.1 Schematic flowchart for the data creation and analysis of large scale sequencing
1.9 新基因的克隆及全长cDNA的确证 对随机测序得到的定向克隆5′端EST，根据以下标准分析其是否为全长cDNA：(1)读框是否完整，ORF的第一个蛋氨酸前是否有终止密码子，如无终止密码子则考虑是否有Kozak序列；(2)ORF上游是否有转录起始点；(3)与已知同源基因比较。对未知基因的全长克隆，通过直接测序获得其全长cDNA序列；对候选新基因的非全长克隆，通过设计引物进行cDNA末端快速扩增(RACE)或用其EST的编码区cDNA作为探针筛选cDNA文库进一步克隆其全长基因。
2 结果
2.1 人DC的扩增培养及鉴定 用GM-CSF和IL-4培养外周血单核细胞至第7天，可见悬浮细胞呈典型的DC形态，FACS分析显示90%以上的细胞表达DC特异性标志CD1a及CD83(图2)，此外还高表达HLA-A，B，C、HLA-DR、B7-1、B7-2、CD40和CD54等免疫分子，而单核细胞特异性标志CD14几乎不表达(＜5%)；同种异体混合淋巴细胞反应显示所扩增的DC能显著刺激同种异体T淋巴细胞的增殖(图3)，证实其具有DC的功能特点，具有很强的免疫刺激功能。
图2 人单核细胞来源DC的表型分析
Fig.2 Phenotypic analysis for human monocyte-derived dendritic cells
图3 人DC体外刺激同种异体T淋巴细胞增殖
Fig.3 Proliferation of allogenic T cells stimulated by human dendritic cells
2.2 人DC质粒文库的鉴定 利用人DC mRNA反转录合成cDNA,定向插入pSPORT2.0载体构建成功人DC的cDNA质粒文库。随机挑取50个克隆进行SalI/NotI酶切和插入子的鉴定分析，结果显示92%以上的克隆均有片段插入，插入片段的平均大小为1.6 kb(图4，选其中15个克隆的酶切结果作为代表)，表明我们成功构建了人DC cDNA质粒文库，可用于大规模随机测序。
图4 人DC cDNA质粒文库随机克隆的SalI/NotI酶切鉴定分析
Fig.4 Insert identification and analysis of the random clones of human DC cDNA library by
SalI/Not I double digestion
2.3 测序结果 利用建立的大规模测序体系，到目前为止，本室共完成EST测序12 000余条，其中已知基因约占75%，代表未知基因的EST共3 000余条(约25%)，新的EST约占16%。将已知基因按照其编码蛋白质功能分为(1)免疫相关基因；(2)基因表达调控基因；(3)细胞结构基因；(4)细胞信号转导相关基因；(5)其他未知功能基因。其中免疫相关基因占EST的4.3%，线粒体基因占2.6%，核糖体基因占8.3%。结果证实CD1a、MHC-Ⅱ、MHC-Ⅰ、CD40、B7-1等与DC功能密切相关的已知免疫分子在DC中的表达丰度较高。2.4 新基因的全长克隆 在3 000余条代表未知基因的EST中，选择与已知基因具有一定同源性、读框明确的EST作为候选新基因，对其中的非全长EST进一步克隆其全长基因，通过分析推测其可能的生物学功能。目前已获得全长新基因109条，包括属于细胞因子、细胞因子受体、趋化因子和粘附分子等家族的免疫新分子，部分全长基因已经在Genebank中登录，有关的免疫功能研究正在开展之中。
3 讨论
大规模测序是近年来随着自动化测序、生物信息学(Bioinformatics)和计算机技术的发展而日益成熟起来的剖析基因组信息的有效方法，是目前人类基因组计划中应用最广泛的技术之一［9］。采用全自动测序仪每台每天的测序量可以达到100 kp以上，使得基因组计划在近年来发展迅猛，每天发现的新基因呈指数增长，原计划于2005年完成的序列图可望提前完成。虽然国内在该领域的研究起步较晚，但近几年来受到重视，已取得了一些成果［1］。
从DC中寻找免疫新分子是目前免疫学领域的一大热点，国际上一些知名的生物技术公司和研究机构，如DNAX、HGS、Immunex、Genetech等竞相涉足该领域。DC新分子的研究对深入阐明DC的分化发育、体内迁移、生物学作用及其分子机理具有重大意义，同时也可能为肿瘤、感染(HIV)、移植排斥和自身免疫性疾病的治疗提供新的思路和手段。Adema等在DC随机测序的EST库中发现了DC能特异趋化初始型T细胞CC趋化因子DC-CK1，提示其可能与DC对Naive T细胞独特的刺激作用有关［10］。Anderson等通过EST的同源比较，从人DC中发现了一种属于TNF受体超家族新成员RANK(Receptor activator of NF-κB)，通过表达克隆进一步克隆到该分子的配体RANKL，并证实RNAK和RANKL的相互作用可以有效维持DC的细胞活力［11］。从人DC cDNA文库中寻找到了DC的溶酶体相关膜蛋白(DC-LAMP)等免疫新分子［12］。我们从DC cDNA基因文库大规模随机测序得到的12 000条EST中克隆到了新的细胞因子、细胞因子受体、趋化因子和粘附因子等免疫新分子，有关其确切的免疫学功能正在深入研究之中。
①本文受国家杰出青年科学基金(39835123)和上海市优秀学科带头人计划(97XD1406)资助
作者简介：章卫平，31岁，博士，主要研究肿瘤免疫和分子免疫学；
曹雪涛，35岁，博士，博士生导师，教授，主要从事肿瘤免疫和分子免疫学研究
4 参考文献
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3 曹雪涛.树突状细胞的基础与临床研究新进展.中国免疫学杂志，1998；14(3)：222
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〔收稿1999-04-09〕