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单克隆抗体3D3重链可变区基因结构分析①
中国免疫学杂志 1999年第6期第15卷 分子与细胞免疫学
作者：史依仁 郭先健 颜江华②
单位：第三军医大学新桥医院呼吸研究所，重庆400037
中国图书分类号 Q523-1
单克隆抗体(McAb)在科研及影像诊断等领域应用十分广泛，鼠源性单克隆抗体，由于其抗原性，在人体疾病治疗应用受到限制，利用DNA重组技术，构建各种重组抗体基因，表达制备重组抗体，可降低其抗原性，前提是必须获得其可变区基因，我们利用设计合成的一对鼠抗体重链可变区引物，采用逆转录PCR方法，扩增抗人肺癌单克隆抗体3D3重链可变区基因［1］，并对其进行测序分析，结果表明该DNA全长354 bp编码118个氨基酸。
1 材料与方法
单克隆抗体3D3杂交瘤细胞常规复苏培养，收集培养细胞约1×108提取杂交瘤细胞总RNA，以细胞总RNA为模板，合成cDNA第一链，再以设计合成引物：VHfor：5′-d［ GATATACCCGGGTGTCAAACTG-
CAGGGAGTCTGG］VHback:5′-d［ATTCTAGACTAGTGAGGAGACGGTGACCAGGGT］，常规PCR扩增，电泳鉴定并回收纯化扩增产物，以粘末端方式将扩增单克隆抗体重链可变区基因克隆到puc18／puc19，双脱氧末端终止法［2］，对插入重链可变区基因测序分析。
2 结果与讨论
测序结果表明单克隆抗体3D3重链可变区基因全长354 bp，编码118个氨基酸，由基因序列推导氨基序列如下：G V K L Q E S G A E L V R D G A D V F L T C A T S D F N I F D T Y I H W V R Q R P E Q G L E W I G R I D P A N A N T N Y D Q K F K D K A T L T A D Y S S N T V F L H V S S L T S A D T A V Y Y C A R W D T T A L F D C W G Q Q TT V S V S S。
同源性分析表明我们获得的DNA序列为单克隆抗体3D3重链可变区基因，与小鼠Ig重链可变区基因同源性达75%～85%，与其它基因序列无显著意义同源。进一步分析表明，该抗体重链可变区基因片段(VH)编码氨基酸序列与小鼠Ig重链可变区Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组同源性分别为45%、71%、49%、60%，又与Ⅱ(c)亚组同源性为最高达78%，连接基因片段(JH)编码氨基酸序列符合JH2基因编码氨基酸序列特点［3］。因此我们认为单克隆抗体3D3重链可变区基因是由胚系可变区基因片段(VH)，多样性基因片段(D)和连接基因段(JH2)重排而成，属Ⅱ(C)亚组。免疫球蛋白重链可变区基因重排机制较复杂，涉及VH，D，JH基因片段识别、切割、连接及碱基剪切、增加等机制，因此，VH、D、JH连接方式多样，造成免疫球蛋白重链可变区高度可变性，尤其表现在重链可变区CDR3。小鼠免疫球蛋白重链CDR3长度由2～19个氨基酸残基组成，表面成分较复杂的抗原刺激产生较长CDR3，使抗体有足够空间与之更好地结合，反之较平坦简单抗原产生CDR3较短［4］，本实验获得VH基因编码CDR1、CDR2、CDR3氨基酸残基分别有5、17、9个。CDR3为9个氨基酸，推测其识别相应抗原较复杂。
单克隆抗体3D3识别抗原在人肺癌细胞膜上有较高表达，我们从其杂交瘤细胞中获得了该抗体重链可变区基因，为进一步构建基因工程免疫毒素打下基础。
①本课题受国家自然科学基金资助(39300015)
②厦门大学抗癌研究中心
作者简介：史依仁，男，32岁，博士
3 参考文献
1 颜江华.抗人肺癌单克隆抗体3D3的研制及其特性鉴定.单克隆抗体通讯，1992；8(3)：22
2 Sanger F, Nicklen S, Conlson A R. DNA Sequencing with chain-terninating inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA 1987;74(12):5463
3 Kabat E A, Wutt, Perry H M et al. Sequences of proteins of immunlogical Interest ［us］, Deparpment of Health and Human Services, Bethasda：NIH, MD, 1991： 4351～4387
4 Chen PP. Structural analysis of human developmentally regulatal VH genes. Scand J Immunol， 1990；(3):257
[收稿1997-07-20 修回1998-03-07]