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柯萨基B3病毒感染增强单个核细胞与心脏微血管内皮细胞的粘附①
中国免疫学杂志 1999年第7期第15卷 分子与细胞免疫学
作者：沈 茜 徐玉莲 凌 伟 吴 泓
单位：第二军医大学附属长海医院临床实验诊断科，上海200433
关键词：柯萨基B组病毒；内皮细胞；细胞间粘附分子-1；单克隆抗体
中国图书分类号 R392.12
摘 要 目的：研究柯萨基B3病毒(Cox B3)感染对内皮细胞表面ICAM-1表达的诱导作用，及对内皮细胞与单个核细胞粘附的影响，探讨病毒性心肌炎心肌细胞免疫损伤的机理。方法：采用流式细胞仪分析内皮细胞ICAM-1表达；粘附试验和单克隆抗体抑制试验观察单个核细胞与内皮细胞的粘附。结果：100和400 TCID50／ml Cox B3感染内皮细胞24和48 h，均可显著增加单个核细胞与内皮细胞的粘附(P＜0.01)，分别为对照组的1.8和2.5倍。经流式细胞仪分析证实，Cox B3感染可以诱导内皮细胞ICAM-1表达增加，阳性细胞数增多。用抗ICAM-1和抗LFA-1单克隆抗体均可部分阻断单个核细胞与Cox B3感染内皮细胞的粘附，抗ICAM-1单抗的抑制作用较抗LFA-1单抗更为明显。结论：Cox B3可以通过感染内皮细胞上调膜ICAM-1的表达，促进单个核细胞与内皮细胞的粘附。
Coxsackie B3 virus infection enhances mononuclear cells adhesion to cultured cardiac microvascular endothelial cells
SHEN Qian, XU Yu-Lian, LING Wei et al.
Department of Clinical Laboratories, Changhai Hospital, Shanghai 200433
Abstract Objective: To investigate the inductive effects of coxsackie B3 virus (Cox B3) infection on ICAM-1 expression of cultured cardiac microvascular endothelial cells and adhesion to mononuclear cells.Methods: Flow cytometry on a FACScan to analyze expression on cardiac microvascular endothelial cells, adhesion assay and monoclonal antibodies inhibition assay to observe the adhesion of mononuclear cells to endothelial cells. Results: Adhesion of rat mononuclear cells to endothelial cells was significantly enhanced following Cox B3 infection for 24 or 48 h (P＜0.01). Cox B3 infection significantly increased ICAM-1 expression on cultured endothelial cells by flow cytometry. Adhesion was reduced by blocking monoclonal antibodies (McAb) to endothlial cells ICAM-1 or mononuclear cells LFA-1, the blocking effect of McAb against ICAM-1 was more obvious than that of McAb to LFA-1.Conclusion: Cox B3 infections of cardiac microvascular endothelia cells can increase surface expression of ICAM-1, and promote inflammatory cell adherence, which could potentially contribute to the cardiac injury of viral myocarditis.
Key words Coxsackie virus B Endothelial cell ICAM-1 Monoclonal antibody
单个核细胞向心肌组织浸润，继而引发的一系列免疫反应是造成心肌细胞损伤的重要因素。循环中的单个核细胞通过膜表面粘附分子及各种细胞因子的介导，与心脏微血管内皮细胞粘附是向心肌移行的关键步骤。柯萨基B3病毒(Coxsackie B3 virus, Cox B3)是一种嗜心病毒，对心脏血管内皮细胞有很高的感染性［1］。病毒可以通过病毒血症或受染白细胞的游走，感染心脏血管内皮细胞，受染内皮细胞表面粘附分子的表达有何改变?对白细胞的粘附效应有无影响?均未见报道。本研究观察了Cox B3感染诱导内皮细胞细胞间粘附分子-1(ICAM-1)表达，及对粘附效应的影响。
1 材料与方法
1.1 病毒 Cox B3(Nancy)引自昆明医学生物研究所，在Wish细胞上增殖并滴定感染性(LgTCID50／ml)。
1.2 单克隆抗体 分泌抗大鼠LFA-1(CD11α)和抗大鼠ICAM-1(CD54)单克隆抗体杂交瘤细胞株WT-1和1A29由日本Miyasaka教授惠赠，常规培养并接种Balb／c鼠诱生腹水。单克隆抗体用辛酸-硫酸铵法［2］部分纯化，活性按文献报道方法进行测定［3］。
1.3 心脏微血管内皮细胞的制备和病毒感染 参照Nishida等［4］的方法，取5～7 d SD大鼠心脏，用Hank′s液洗尽血液，去除瓣膜、大血管等，剪开心室将心脏浸入75%乙醇30 s以灭活心外膜和心内膜内皮细胞。剪碎心肌组织，用0.2%胶原酶(Ⅱ型，Sigma)和0.1%胰蛋白酶(Difco)37℃水浴消化20 min，细胞过200目筛网，悬于10%小牛血清RPMI1640培养基。接种于0.2%、明胶(Sigma)预处理的培养皿培养4 h，去除未粘附细胞，更换含50 mg/L肝素(Sigma)、10 mg/L内皮细胞生长因子(Boehringer)的RPMI1640完全培养基。3～4 d换液1次，直至长成细胞单层，实验选用3～4代的内皮细胞，0.25%胰蛋白酶消化备用。选择100、400 TCID50／ml Cox B3感染内皮细胞，病毒吸附2 h。细胞洗涤后继续培养24、48 h。
1.4 单个核细胞的制备和激活 大鼠乙醚麻醉，无菌取下腔静脉抗凝血，常规用淋巴细胞分离液分离单个核细胞。洗涤2次后，用10%小牛血清RPMI1640培养基培养，并加入终浓度为5 μg/ml的Con A(Sigma)活化淋巴细胞。取活化48～72 h的淋巴细胞备用。
1.5 单个核细胞与内皮细胞的粘附试验及单克隆抗体的阻断效应 弃去内皮细胞的培养基，用Hank′s液洗1次。将激活淋巴细胞调整浓度至5×105 ml-1，加入内皮细胞培养板中，每孔0.1 ml。置37℃5%CO2培养箱粘附2 h。轻震培养板后弃尽孔内液体，用预温生理盐水洗2次，洗去未粘附细胞。每孔加入2%刚果红0.1 ml，室温染色20 min。弃染液，用生理盐水轻洗2次。0.01 mol／L PBS-乙醇液脱色，自动酶联仪测定λA570 nm，参考波长λ690 nm。设单个核细胞与500 U TNFα诱导内皮细胞、未感染内皮细胞粘附为阳性和阴性对照。设单纯内皮细胞和单个核细胞孔、同剂量病毒感染内皮细胞孔为对照。
将抗LFA-1和ICAM-1单抗20 μg/ml分别加入粘附实验孔中，共同孵育，余步骤同上。以同浓度小鼠抗甲状腺球蛋白单克隆抗体为对照。
1.6 流式细胞仪分析 将Cox B3感染24、48 h的内皮细胞用0.25%胰蛋白酶消化分散，生理盐水洗3次。加入20 μg/ml抗ICAM-1单抗，4℃作用40 min。洗涤3次后，加入1∶100 FITC-抗鼠IgG(购自华美生物试剂公司)，4℃作用40 min。洗涤后用0.2%多聚甲醛固定20 min，悬于PBS液中。用流式细胞仪(Becton Dickinson)分析内皮细胞ICAM-1的表达情况。
1.7 数据处理 采用Student“t”检验。
2 结果
2.1 Cox B3感染增强单个核细胞与内皮细胞的粘附 用100、400 TCID50／ml Cox B3感染内皮细胞24～48 h，内皮细胞无明显形态学改变。与正常内皮细胞相比，活化淋巴细胞与Cox B3感染内皮细胞的粘附能力显著增强(表1)(t=10.71；4.67；P＜0.01)；分别为对照未感染组的1.81和2.50倍。虽然感染48 h组内皮细胞与单个核细胞的粘附率略高于感染24 h组，但无统计学意义(P＞0.05)。
表1 Cox B3感染内皮细胞对粘附作用的影响
Tab.1 Enhancement in adhesion of activation mononuclear cells to Cox B3 infected endothelial cells
| Experimental groups | Adhesion(%)(n=3,x±s) | |
| 24 h | 48 h | |
| Infected with 100 TCID50／ml | 57.82±3.45 | 63.02±4.25 |
| Infected with 400 TCID50／ml | 41.94±5.37 | 47.14±6.32 |
| Uninfection | 23.12±4.47 | |
| TNFα-induction | 46.50±5.06 | |
| IL-1β-induction | 60.07±6.07 | |
2.2 抗LFA-1和抗ICAM-1单克隆抗体对粘附的抑制作用 用400 TCID50／ml Cox B3感染内皮细胞24 h，加入20 μg/ml抗LFA-1或抗ICAM-1单克隆抗体，观察ICAM-1或LFA-1在粘附效应中的作用。发现两种抗体均可减少单个核细胞与内皮细胞的粘附(图1)，抗ICAM-1单抗的抑制作用较抗LFA-1单抗更为明显。对照单抗无抑制作用。
图1 抗LFA-1和抗ICAM-1单抗对粘附的抑制作用
Fig.1 Inhibition on adhesion with McAbs to LFA-1 and ICAM-1
2.3 Cox B3感染增加内皮细胞膜ICAM-1的表达 100、400 TCID50／ml Cox B3感染24和48 h的内皮细胞，经流式细胞仪分析膜ICAM-1表达情况，结果见表2、图2。未感染静止期的内皮细胞ICAM-1的表达的阳性细胞仅4.86%，而经Cox B3感染24～48 h的内皮细胞ICAM-1均表达显著；400 TCID50／ml感染48 h，上调ICAM-1表达的作用更为明显，阳性细胞增至36.97%。
表2 Cox B3感染诱导内皮细胞ICAM-1表达的FACS分析
Tab.2 Expression of ICAM-1 on Cox B3-infected endothelial cells by FACS analysis
| Virus concentration
(TCID50／ml) |
Positive cells(%) | |
| 24 h | 48 h | |
| 100 | 19.26 | 24.96 |
| 400 | 26.03 | 36.97 |
| Uninfection | 4.86 | |
图2 内皮细胞ICAM-1表达的FACS分析
Fig.2 Expression of ICAM-1 on endothelial cells by flow cytometry
3 讨论
正常情况下，血管内皮细胞处于静止状态，只有P-选择素等少数几种粘附分子的低水平表达。因此，血管内皮细胞与循环中白细胞的粘附非常少。然而，白细胞与血管壁内皮细胞的粘附，是白细胞向病损部位移行的关键步骤，这种粘附过程往往发生于近靶器官的微血管。目前已证实，内皮细胞可被各种炎性介质如TNFα、IL-1β等所激活，使其表面粘附分子表达增多，与白细胞的粘附增强［5］。近来又发现，流感病毒、副流感病毒和呼吸道合胞病毒等感染呼吸道上皮细胞，可以诱导上皮细胞膜ICAM-1表达增多，与中性粒细胞的粘附增强［6，7］。
ICAM-1是白细胞粘附于血管内皮细胞的一个重要粘附分子，也是白细胞表面LFA-1的配体。我们的研究结果表明：Cox B3感染心脏微血管内皮细胞，可以显著增加内皮细胞膜ICAM-1的表达，使阳性细胞从4.86%增至36.97%，并且明显促进活化淋巴细胞与内皮细胞的粘附。为了进一步证实LFA-1／ICAM-1是参与淋巴细胞与心脏微血管内皮细胞粘附过程的主要粘附分子，我们用相应单克隆抗体对粘附过程进行阻断。结果发现，这两种单抗对粘附均有部分抑制作用，但抗ICAM-1单抗的抑制作用更为明显。表明Cox B3感染诱导内皮细胞与活化淋巴细胞粘附效应增强，与Cox B3感染诱导内皮细胞膜ICAM-1表达增多密切相关。病毒感染如何上调受感染细胞粘附分子表达，目前尚未阐明。但是，病毒感染尚可诱导炎性介质或趋化因子的分泌，内皮细胞激活后也可分泌多种细胞因子和活化物质，如IL-8、PAF、内皮素等。因此，Cox B3感染诱导内皮细胞ICAM-1表达，是否与内皮细胞激活分泌活性物质有关，尚待进一步实验阐明。抗粘附分子抗体可以有效地阻断粘附过程，必将减少循环中单个核细胞的穿壁、向心肌组织游走，减轻淋巴细胞浸润造成的心肌细胞损伤，有助于免疫性心肌炎的临床治疗。
①本课题受国家自然科学基金资助(39470655)
作者简介：沈 茜，女，44岁，医学博士，研究员，博士生导师，主要研究病毒感染与自身免疫性疾病
4 参考文献
1 Huber S A, Haisch C， Lodge P A. Functional diversity in vascular endothlial cells:Role in Coxsackie virus tropism. J Virol, 1990;64(8):4516
2 陈伯权，吴美英，叶群瑞.几种部分纯化单克隆抗体方法的比较.病毒学报，1990；6(2)：122
3 Tamatani T, Miyaoaka M. Identification of monoclonal antibodies reactive with the rat homology of ICAM-1 in the adherence of reating versus activated lymphocytes to high endothelial cells. Int Immunol, 1990;2(1):165
4 Nishida M, Carley M N, Gerritsen M E et al. Isolation and characterization of human and rat cardiac microvascular endothelial cells. Am J Physiol, 1993;264(2):H639
5 Pober J S, Gimbrone M A, Lapierre L A et al. Overlapping patterns of human endothelial cells by interleukin 1; tumor necrosis factor, and immune interferon. J Immunol, 1986;137(4):1893
6 Stark J M, Godding V, Sedgvick J B et al. Respiratory syncytial virus infection enhances neutrophil and eosinophil adhesion to cultured respiratory epithelial cells. J Immunol, 1996;156(10):4774
7 Tosi M F, Stark J M, Hamedani A et al. Intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1)-dependent and ICAM-1-independent adhesive interactions between polymophonuclear leukocytes and human airway epithelial cells infected with parainfluenza virus type 2. J Immunol, 1992;1497(7):3345
收稿1997-01-18 修回1997-12-01