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HLA-A02基因型与中国高发区肝细胞癌的密切关联
中国免疫学杂志 1999年第7期第15卷 肿瘤免疫学
作者：明利华 朱源荣 Curtis C. Harris 王晓宏 吴志远 孙宗棠
单位：明利华 王晓宏 吴志远 孙宗棠 中国协和医科大学中国医学科学院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室，北京100021；朱源荣 中国江苏省启东肝癌研究所，启东226200；Curtis C. Harris National Cancer Institute, NIH, Bethesda, MD 20892, USA
关键词：HLA-A02；肝细胞癌；p53基因；点突变
中国图书分类号 R730.3
摘 要 目的：探讨HLA-A02型及其亚型与启东肝细胞癌的相关性。方法： 用PCR-SSP法分析启东肝细胞癌和正常人中HLA-A02型及其亚型的分布。结果：103例经病理诊断的肝细胞癌中57例为HLA-A02型，其比例达到55%，显著高于启东正常人群HLA-A02型32%(33/102)的比例, P＜0.001。同时揭示包括HLA-A02型在内的HLA-A位点的等位基因多为杂合型。启东肝细胞癌HLA-A02型中A0201亚型所占的比例稍高于正常人群，但没有显著差异。分析比较表明，启东肝细胞癌中HLA-A02型的相对集中与当地肝癌中p53基因249密码子突变的高频度发生并没有关联。结论：在乙肝病毒和黄曲霉毒素均为危险因子的启东地区，HLA-A02型与肝细胞癌密切相关。
Association of HLA-A02 genotype with hepatocellular carcinoma in a prevalent area of China
MING Li-Hua, ZHU Yuan-Rong, Curtis C. Harris et al.
Cancer Institute, Peking Union Medical College
Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100021.
ZHU Yuan-Rong
Liver Cancer Institute, Qidong 226200.
Curtis C. Harris
National Cancer Institute, NIH, Bethesda, MD 20892, USA
Abstract Objective: The association of HLA-A02 genotype and its subtypes with hepatocellular carcinoma (HCC) was investigated in a prevalent area, Qidong of China.Methods: The HLA-A02 genotype were studied by using PCR-SSP.Results: 57 of 103 HCC were found to be of HLA-A02 genotype. In contrast, 33 of 102 normal people of Qidong were identified to be of HLA-A02. The difference is statistically highly significant (P＜0.001). The HLA-A locus alleles were found to be mostly heterozygous. The distribution of A02 subtypes was similar to that of normal peoples. 249 codon mutation status of p53 gene of HCC was identified by PCR and HaeIII RFLP analysis, confirmed by DNA sequencing. The results showed that the 249 codon mutation frequency of p53 gene was not associated with the A02 genotype.Conclusion: In an area where HBV and aflatoxin were risk factors, a close association of HLA-A02 genotype with hepatocellular carcinoma was identified. This genotype clustering was not associated with the unique 249 codon hotspot mutation of the p53 gene.
Key words HLA-A02 Hepatocellular carcinoma p53 gene Missense mutation
肿瘤的发生受到许多外界环境因素的影响，机体的内在因素也在起作用。中国高发区启东的肝细胞癌有其独特性［1］，在乙肝病毒感染和黄曲霉毒素作用的背景下，p53基因249密码子发生着高频度错义突变［2-4］，这种突变伴随着p53蛋白在癌细胞核内较普遍的积累［4］。已知一些人工合成的p53多肽与HLA-A02型的亚型分子A0201具有高亲和力，在体外实验和动物实验中能激活这种多肽特异性地与HLA-A02基因型相匹配的杀伤性T细胞［5，6］。因此，在启东肝细胞癌中对HLA-A02基因型的分布及其与p53的相互关联性进行研究, 将有助于探讨免疫治疗的潜力以及肝细胞癌发生的内在因素。
基于上述原因，对103例启东肝细胞癌和102例正常人群血液样本的HLA-A02基因型的分布及其与p53基因249密码子的错义突变的关联性进行了分析。结果首次发现启东肝细胞癌HLA-A02型的比例非常显著地高于启东正常人群HLA-A02型的比例。HLA-A位点定型分析的结果表明HLA-A位点的等位基因在启东肝细胞癌样本中多为杂合子，作为对比的北京肝细胞癌中HLA-A02型的比例与正常人群相近。启东肝细胞癌中HLA-A02基因型的相对集中与特征性的p53基因249密码子错义突变的高频度没有关联。
1 材料与方法
1.1 肝细胞癌标本 所有肝细胞癌手术标本均为经病理诊断、由启东肝癌研究所和中国医学科学院肿瘤医院提供的手术标本。启东正常人群血液标本由启东肝癌研究所提供。
1.2 组织DNA及血液标本DNA的提取 组织经研磨、血液标本经离心，收集细胞后，经蛋白酶K消化，用酚/氯仿法提取DNA。
1.3 HLA-A位点PCR-SSP法分型 用英国Bristol大学移植科学部提供的第二代PCR-SSP试剂盒对HLA-A位点进行分型，每例样本以26对序列特异性引物分别在26个微量离心管内，以10 μl的反应体积进行PCR反应，反应条件为96℃变性60 s；96℃ 25 s, 70℃ 45 s, 72℃ 30 s, 5个循环; 96℃ 25 s, 65℃ 45 s, 72℃ 30 s, 20个循环; 96℃ 25 s, 55℃ 60 s, 72℃ 120 s, 5个循环；72℃ 10 min。同时每个反应管中加有扩增苯丙氨酸羟化酶(PAH)第7外显子约200 bp片断的内对照引物。2%的琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，根据电泳图谱确定HLA-A位点上A1至A80共25个等位基因的型别。
1.4 HLA-A02型及其亚型的PCR-SSP法分析 检测HLA-A02型及其亚型的引物，根据文献［7］用ABI DNA合成仪合成。扩增HLA-A02型的PCR反应条件同上。
将HLA-A02型的PCR产物100倍稀释后，加1 μl 到9 μl HLA-A02亚型分析的反应体系中进行PCR扩增，反应条件为95℃ 15 s，60℃ 30 s，5个循环；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s，10个循环; 72℃ 10 min。2%的琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，根据电泳图谱确定HLA-A02的亚型。
1.5 数据的统计分析 数据的统计分析采用Epiinfo 6中的Epitable统计软件，计算出2个相比较的频度之间的χ2和P值。
1.6 HaeIII RFLP及DNA测序分析p53基因249密码子的突变状况 根据已报道的序列合成引物［2］，从肝细胞癌组织中提取DNA，巢式PCR反应扩增出包含249密码子及其旁侧序列在内的p53基因第7外显子约200 bp的片段，经HaeIII酶切, 2%的琼脂糖凝胶电泳，根据限制性片断长度多态性(RFLP)的图谱确定p53基因249密码子为突变型还是野生型［8］。部分样本的PCR产物直接测序以证实RFLP的结果。
2 结果
2.1 肝细胞癌中HLA-A02型的分布 HLA-A位点定型分析结果表明在启东肝细胞癌样本中HLA-A位点多数为杂合子。其中HLA-A02型等位基因较为多见，HLA-A位点的其它型较为分散。图1显示其中1例样本的分析结果。在全套26个反应中都可见200 bp的PAH内对照片断，表明此例PCR结果是有效的。图中c和h列各有一条带，显示该例样本为HLA-A02/A09的杂合型，其中c列呈现HLA-A02型的特征带，M为DNA分子量参照物。
由于在启东肝细胞癌样本中HLA-A02型较为常见，因此合成了一对HLA-A02型序列特异性的引物，对启东103例肝细胞癌和102例正常人中HLA-A02型的分布进行了PCR-SSP分析。每次PCR-SSP分析实验都设立3～5个阴性对照，在200多例样本的检测过程中，共进行了30多例阴性对照反应，从未出现过阳性，因此可以排除PCR反应中因污染而出现假阳性的可能。HLA-A02型的分析结果归纳于表1，在103例启东肝细胞癌样本中HLA-A02型的比例达到55% (57/103)，显著高于启东102例正常人中HLA-A02型32%(33/102)的比例。 用Epiinfo 6中的统计软件对2个频度进行比较，结果χ2=11，P＜0.001，二者之间的差异非常显著。而北京25例
图1 启东肝癌HLA-A位点的分析
Fig.1 Genotyping of HLA-A locus of HCC DNA from Qidong
Note:the sample having a band of 813 bp at lane c contains HLA-A02 allele
表1 肝细胞癌患者与正常人群中HLA-A02基因型的频率
Tab.1 Frequency of HLA-A02 genotype in HCC patients and normal people
| Area | Group | Frequency of
HLA-A02 genotype |
Frequency of
A0201 subtype |
| Qidong | HCC | 55% (57/103)1) | 67% (34/51) |
| Normal | 32% (33/102)1) | 49% (16/33) | |
| Beijing | HCC | 36% (9/25) | Not done |
| Normal | 28% (55/200)2) | 36% (20/55)2) |
note:1)HLA-A02 frequency in Qidong HCC is very significantly higher than that in Qidong normals, see details in text；2)data cited from ref. 6
肝细胞癌标本中仅有9例为HLA-A02型,与启东及北京地区正常人群HLA-A02型的比例相近。图2显示了随机抽样的启东肝癌样品HLA-A02型的PCR-SSP分析结果，其中m列为阴性对照，n列为DNA分子量参照物，b,c,e,f,i,j,l几列都有一条813 bp的带，为HLA-A02型，其余的为非HLA-A02型，图2显示HLA-A02型占半数以上。
图2 启东肝细胞癌HLA-A02型的分析
Fig.2 Identification of HLA-A02 genotype of HCC from Qidong
Note:the sample having a band of 813 bp contains HLA-A02 allele
上述结果表明在乙肝病毒和黄曲霉毒素均为危险因子的启东地区［1］，HLA-A02型与肝细胞癌密切相关。
2.2 肝细胞癌中HLA-A0201亚型的分布 HLA-A0201亚型的分析结果表明启东肝细胞癌样本中A0201亚型在HLA-A02型中的比例稍高于启东正常人群中A0201亚型在HLA-A02型中的比例(表1)，但这种差异并没有统计学意义(P=0.8)。
2.3 HLA-A02基因型与p53基因249密码子突变之间的关联性 如表2所示，RFLP法分析51例HLA-A02型的启东肝细胞癌样本中p53基因249密码子的状况，结果28例p53基因249密码子为突变型，23例为野生型，突变型所占的比例为54.9%。同法对42例非HLA-A02型的启东肝癌样本进行分析，结果22例p53基因249密码子为突变型，20例为野生型，突变型所占的比例为52.4%。随机抽样对部分启东肝癌样本的PCR产物进行直接测序，分析p53基因249密码子的突变状况，结果与RFLP结果完全一致。对HLA-A02组和非HLA-A02组249密码子突变型所占的比例进行统计学分析(方法同上)，结果χ2=0.06, P=0.8，表明HLA-A02型与p53基因249密码子突变这2个频度间没有相关性。
表2 启东肝细胞癌HLA-A02型与p53基因249密码子突变频率的关联性
Tab.2 Association data between the frequency of HLA-A02 genotype and p53 hotspot mutation
| Genotype | 249 codon
mutants |
249 codon
wildtype |
Total number
of HCC |
| HLA-A02 | 28 | 23 | 51 |
| Non HLA-A02 | 22 | 20 | 42 |
Note:statistical analysis showed no association (see text)
3 讨论
文献报道p53蛋白的一些活性多肽与HLA-A02型的亚型分子A0201具有较高的亲和力，在体外实验和动物实验中能激活p53多肽特异性地与HLA-A02基因型相匹配的杀伤性T细胞［5，6］。启东肝细胞癌p53基因独特的249密码子的热点突变伴随着p53蛋白在癌细胞中普遍地大量积累［4］。p53蛋白在癌细胞中积累就使其有可能被机体的蛋白水解酶系统降解成小肽，而被HLA I类分子托出到癌细胞表面，成为杀伤性T细胞识别的靶子，使这种癌细胞成为被激活了的机体免疫系统的清除对象［5］，因此启东肝细胞癌可能是基于p53的免疫治疗的合适对象。HLA-A02型的分析结果显示，启东地区肝细胞癌病例中HLA-A02型以较高频度出现，表明HLA-A02型与启东肝细胞癌密切相关，而成为当地肝癌的一个易感因素。这对以启东肝细胞癌为对象并基于p53的免疫治疗的设计是一个值得深入探讨的课题。
HLA-A02基因型的分析结果显示HLA-A02的纯合型在启东肝细胞癌中并未占有优势，说明HLA-A02与启东肝癌的关联不是由于启东肝癌中HLA-A02的纯合型较多的缘故。在乙肝病毒和黄曲霉毒素的共同作用下，启东肝细胞癌p53基因249密码子的热点突变达到约50%［1-3］。启东肝癌中HLA-A02型的频度也为50%左右，那么启东肝癌中HLA-A02型的集中分布与p53基因249密码子的热点突变是否有密切关联呢？实验结果及统计分析否定了这二者之间的关系，因此不能用249密码子的热点突变来解释启东肝癌中HLA-A02型的高频度。曾有报道认为HLA-B8、B17、Cw7、DR3等型在肝细胞癌病例中出现的频率较高。HLA-B8和DR3等型表现出免疫系统某些性状的改变并易患一些免疫性疾病［9，10］，但并没有对这种相关性的实质作出解释。HLA-A02型是否涉及免疫系统及其他系统的改变从而影响到启东肝癌的发生也有待进一步研究。
作者简介：明利华，男，32岁，博士，主要从事肝细胞癌病因和免疫防治的研究；
孙宗棠，男，教授，博士生导师，主要从事肝癌病因、组织发生及免疫防治的研究
4 参考文献
1 Sun T, Wu S, Wu Y et al. Measurement of individual aflatoxin exposure among people having different risk to primary hepatocellular carcinoma. In: Hayashi Y et al ed. Diet, Nutrition and Cancer. Tokyo: Japan Sci Soc Press, 1986: 225-235
2 Hsu I C, Metcalf R A, Sun T et al. Mutational hotspot in the p53 gene in human hepatocellular carcinomas. Nature, 1991; 350 (6317): 427
3 Fujimoto Y, Hampton L L, Wirth P J et al. Alterations of tumor suppressor genes and allelic losses in human hepatocellular carcinomas in China. Cancer Res, 1994; 54 : 281
4 明利华，袁宝珠，Thorgeirsson S S et al.中国高发区肝细胞癌P53基因热点突变的规律性.中华肿瘤杂志,1999;21(2)：122
5 Theobald M, Biggs J, Dittmer D et al. Targeting p53 as a general tumor antigen. Proc Natl Acad Sci USA, 1995; 92 (26):11993
6 侯亚非，孙宗棠，Appella E et al.北方汉族人群HLA-A2亚型分布及p53的合成肽体外诱导CTL反应.中华微生物学和免疫学杂志，1999；19(1)：47
7 Krausa P, Brywka III M, Sarage D et al. Genetic polymorphism within HLA-A02: significant allelic variation revealed in different populations. Tissue Antigens, 1995; 45: 223
8 Ozturk M， Collabozators. p53 mutation in hepatocelluar carcinoma after aflatocin exposure. Lancet, 1991; 338: 1356
9 Ricci G, Colombo C, Ghiazza B et al. HLA-A,B,C,DR and DQ expression and hepatocellular carcinoma: study of 205 italian subjects. Cancer Lett, 1995; 98 (1): 121
10 Yang P M, Sung J L, Chen D S. HLA-A, B, C and DR antigens in chronic hepatitis B viral infection. Hepatogastroenterology, 1989; 36 (5): 363
收稿1998-10-22 修回1998-11-11