血管内皮生长因子的免疫学测定法

血管内皮生长因子的免疫学测定法

中国免疫学杂志 1999年第8期第15卷 免疫学技术与方法

作者：王贵齐　董志伟　王耐勤　刘彤　徐光炜

单位：中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤研究所，北京 100021

关键词：血管内皮生长因子；肿瘤；放射免疫分析；细胞上清

　　摘　要　目的：检测肿瘤细胞条件培养液中VEGF的表达量。方法：在表达及分离纯化VEGF的基础上，成功地制备了VEGF抗体，以夹心法测定VEGF。结果：VEGF测定范围为0.02～200.00 ng/ml，灵敏度可达0.02 ng/ml，批内及批间变异均小于10%，回收率平均为102.4%。其中人胃癌细胞MGC803、BGC823、乳癌MCF-7及肝癌BEL-7402分泌上清中VEGF的含量分别为6.50 、0.45 、0.90 及1.45 ng/ml。结论：不同的肿瘤细胞系其VEGF的分泌量是不同的，应用此方法可以检测肿瘤病人血清中的VEGF。

　　中国图书分类号　Q58

Radioimmunoassay of vascular endothelial growth factor

WANG Gui-Qi， DONG Zhi-Wei,WANG Nai-Qinet al.Cancer Institute,Chinese Academy of Medical Science,Peking Union Medical College,Beijing 100021.Clinical Oncology College ,Beijing Institute for Cancer Research,Beijing Medical University,Beijing 100034

　　Abstract　Objective: To detect expression level of VEGF is important for determining biological behaviour of tumor cells.Methods: Based on isolation, purification and expression of VEGF,successfully prepared anti-VEGF antibody and developed a sandwich radioimmunoassay for VEGF.Results: Detectable range of VEGF is between 0.02 and 200.00 ng/ml.The sensitivty or minimal detectable concerntration dose was difference of sample in the same group and among groups were all less than 10 percent. By the assay it is indicated that all four kinds of tumor cell lines secreted VEGF, MGC803, BGC823, MCF-7 and BEL-7402 separeately secreted 6.50,0.45, 0.90 ，1.45 ng/ml.Conclusion: VEGF can be detected in the serum of tumor patient with this assay.

　　Key words　Vascular endothelial growth factor　Tumor　Radioimmunoassay　Cell conditioned medium

　　血管内皮生长因子(VEGF)是重要的血管形成因子,与诸多生理及病理过程有关^［1］,已知某些肿瘤细胞可分泌VEGF,后者与血管内皮细胞上的受体相结合,可诱导肿瘤血管形成,维持肿瘤的继续生长^［2-4］。若干研究报道已指出,肿瘤患者的预后与肿瘤组织的血管密度明显相关^［5-6］,因此测定某些肿瘤组织细胞分泌VEGF的能力是判定该肿瘤组织细胞的生物学指征之一。本文在表达及纯化人重组VEGF的基础上,制备了相应的抗体,并建立了放射免疫测定方法检测VEGF。

　　1　材料与方法

　　1.1　动物、细胞及试剂　新西兰白兔购自北京医科大学第一附属医院动物中心。MGC803、BGC823、MCF-7及BEL-7402分别为本所冻存的人胃癌、乳癌及肝癌细胞系,NIH3T3为小鼠成纤维细胞购自美国的ATCC。溴化氰活化的SepharoseCL-4B购自Pharmacia公司,牛血清白蛋白(BSA)购自华美公司,多聚赖氨酸、Iodogen、胎牛血清(FCS)购自Sigma公司, RPMI 1640购自Gibco公司。¹²⁵I购自中国科学院原子能研究所。

　　1.2　VEGF的表达及分离纯化　VEGF的重组原核表达载体pKPL-3b-VEGF由北京医科大学汤健教授惠赠,以之转化POP-2136菌(北京医科大学马大龙教授惠赠),42℃培养4～6 h诱导外源基因的表达。离心沉淀菌体,超声裂解。离心弃上清。沉淀经终浓度为10%SDS、8 mol/L尿素及2 nmol/L二巯基乙醇变性处理后,进行SDS-PAGE(10%）制备性电泳^［7］,切下VEGF的相应带,置透析袋中电泳洗脱,在洗脱液中加入4倍体积的复性液,室温洗脱6～12 h,PBS(pH 7.4)透析24 h。

　　1.3　VEGF的活性测定　根据杨小平法加以改进^［8］。离体24 h以内的人脐静脉,经消化8～10 min获得内皮细胞,其条件培养液为RPMI 1640,含30%FCS、2 mmol/L谷氨酰胺、90 ng/ml肝素钠、1 ng/ml氢化考的松及2 ng/ml庆大霉素。96孔板以0.01%多聚赖氨酸包被后,加原代人脐静脉内皮细胞,4×10³个/孔,加入不同浓度的VEGF, 每个浓度有3个重复孔。5 d后加入³H-TdR 1.0 μCi/ml，培养6 h后以(Beckman LS 3801型)液闪仪测其cpm值。

　　1.4　VEGF抗体的制备及纯化　新西兰白兔以纯化的VEGF免疫,1～2 mg/(只*次)。首次免疫加福氏完全佐剂,背部皮内多点注射。之后每月加强免疫一次,加福氏不完全佐剂。末次免疫10 d后以免疫双扩散测其效价并收集血清。抗血清经等体积饱合硫酸氨沉淀后,以PBS透析。加入自制的CN Activated Sepharose-CL-4B-VEGF亲合层析柱中, 彻底洗脱后,以0.1 mol/L HCl-甘氨酸(pH 2.8)洗脱,并收集峰管,Tris中和后以PBS透析、分装保存。

　　1.5　肿瘤细胞条件培养液VEGF的放免测定　96孔软板(日本住友,Falcon型)以纯化的VEGF抗体(10 μg/ml)包被过夜,以1%BSA封闭1 h,洗涤后加入待测的细胞培养上清（细胞培养液为RPMI 1640,含15%FCS），室温反应1 h,彻底洗涤后加入¹²⁵I标记的VEGF抗体（1 μCi/μg,250 000 cpm),室温反应1 h后彻底洗涤,切割后以γ计数器(国营二六一厂 FH 408型自动定标仪)测其cpm值。VEGF抗体的标记采用Iodogen法。

　　2　结果

　　2.1　VEGF及其抗体的纯度与活性　VEGF在本原核表达体系中以包涵体的形式存在,经变性、制备电泳及复性可获得一纯度较高的43 kD重组蛋白即人重组VEGF（图1），复性后的蛋白经HPLC的反相层析(Cosmosi14, 6 ×150 mm, Fo9033,5C18-P-300)表现为单一峰,并可显著刺激人脐静脉内皮细胞的生长,并呈剂量依赖关系（图2）。以其免疫制备的VEGF抗血清的滴度(免疫双扩散)可达1∶32,分离纯化后仍维持与VEGF的结合活性。

图1　人重组血管内皮生长因子SDS-PAGE分析

　　Fig.1　Analysis of recombinant VEGF product (pKPL-3b-VEGF in POP-2136)

　　Note:Lane 1.total cell extracxt of control bacteria not transformated with pPKPL-3b-VEGF; Lane 2. total cell extract of pKPL-3b-VEGF transformed bacteria in non temperature induced condition; Lane 3. total cell extract of pKPL-3b-VEGF bacteria in temperature-induced; Lane 4.supernatant from total cell extract from induced bacteria; Lane 5. inclusion body ;Lane 6. supernatant of inclusion body;Lane 7. inclusion body after washing； Lane 8. purified recombinant vascular endothelial growth factor; M.low molecular weight protein marker

图2　血管内皮生长因子对人脐静脉内皮细胞增殖的影响

　　Fig.2　Effect of VEGF concentration on growth and ³H-thymidine incorporation of human umbilical vein endothelial cells

　　2.2　VEGF标准曲线

　　2.2.1　¹²⁵I-抗VEGF抗体的免疫活性　其放纯度大于90%,比活度超过694 kBq/μg。

　　2.2.2　特异性　与细胞条件培养液中白蛋白、球蛋白的交叉反应分别为0.56%及0.47%。

　　2.2.3　回收试验　在细胞条件培养液（与人脐静脉内皮细胞条件培养液相同）中分别加入低中高不同浓度的VEGF。计算回收率分别为97.8%、103.9%及105.6%,平均102.4%。

　　2.2.4　VEGF经夹心法测定的标准曲线　测定的范围为0.02～200.00 ng/ml,灵敏度为0.02 ng/ml(图3)。

图3　VEGF标准曲线

　　Fig.3　Standard curve of VEGF through RIA

　

表1　VEGF测定的批内变异

　　Tab.1　Inter-assay coefficient of variation VEGF determined in the same assay group

Sections			cpm
	0.02 ng	0.20 ng	2.00 ng	20.00 ng	200.00 ng
Section 1	2 314	2 697	5 031	9 019	11 219
Section 2	2 115	2 814	4 738	9 470	10 528
Section 3	2 201	2 715	4 875	9 184	10 045
	2 210±100	2 736±70	4 881±148	9 224±228	10 595±590
cv(%)	4.5	2.5	3.0	2.4	5.6

表2　VEGF测定的批间变异

　　Tab.2　CV of VEGF determined in the different assay groups

Groups			cpm
	0.02 ng	0.20 ng	2.00 ng	20.00 ng	200.00 ng
Group 1	2 292	2 829	4 896	9 095	10 911
Group 2	2 210	2 736	4 881	9 224	10 595
Group 3	2 196	2 747	4 929	9 429	10 056
	2 232±52	2 763±58	4 902±25	9 249±168	10 854±235
cv(%)	2.3	2.0	0.5	1.8	2.1

表3　肿瘤细胞条件培养液中VEGF的分泌水平

　　Tab.3　Levels of VEGF secreted from conditioned media of various cultured cells

Cell lines	cpm(	Levels of VEGF(ng/ml)
HUVEC1)	1 965±48.32	-
NIH 3T3	1 911±54.35	-
MGC 803	8 774±83.17	6.50
BGC 823	3 255±91.03	0.45
MCF-7	3 560±56.68	0.90
BEL-7402	4 625±61.47	1.40

　　note:1)human umbilical vein endothelial cells2.2.5　VEGF测定的精确度　每个稀释度各作3个平行孔，测得的批内变异分别为5.4%, 6.2%、7.0%及6.4%，平均为 6.0%。连续测两次，批间变异平均为7.4%，均小于10.0%。表1及表2分别为VEGF测定的批内及批间变异。

　　2.3　某些肿瘤细胞分泌上清中VEGF含量的测定　表3为测得的人胃癌细胞MGC803、BGC823、乳癌细胞MCF-7及肝癌细胞BEL-7402分泌上清中VEGF的含量。

　　3　讨论

　　在建立VEGF的测定方法(夹心法)中,VEGF及其抗体是关键试剂,二者的纯度及活性均对测定的结果有直接影响。由于目前尚无市售的VEGF抗体,而VEGF的纯品又售价过高,因此本实验表达纯化了VEGF,并以此免疫新西兰兔获得抗体。结果表明本实验制备的VEGF及其抗体的纯度及活性均达到要求。标准曲线显示,采用夹心法测定VEGF,其检测范围为0.02 ～200.00 ng/ml,灵敏度达0.02 ng/ml,批内及批间变异均小于10%, 回收率平均为102.4%。说明该法的特异性、灵敏度、稳定性及检测范围均较好。4种人肿瘤细胞分泌上清VEGF含量的检测结果显示,不同的肿瘤细胞其VEGF分泌量不同,本实验中的人胃癌细胞MGC803为最高,可达6.50 ng/ml,其次为肝癌细胞BEL-7402 乳癌细胞MCF-7及胃癌细胞BGC823,分别为1.40 、 0.90 及0.45 ng/ml。

　　VEGF的测定方法报道甚少,且尚未标准化。其次,VEGF的分泌量与肿瘤细胞的恶性程度及转移能力的确切关系亦尚待验证,这是今后需要解决的问题。

　　致谢：本文得到北京医科大学心血管研究所汤健教授、分子免疫室马大龙教授及中国科学院化学所刘国全教授的热心支持和帮助, 一并致以衷心的感谢。

　　北京医科大学临床肿瘤学院，北京 100034

　　作者简介：王贵齐，男，34岁，肿瘤学专业博士；

　　董志伟，男，教授，博士生导师，主要研究抗体工程

　　4　参考文献

　　1　Folkman J, Klaysburm M. Angiogenetic factor. Science,1987;235:442

　　2　Folkman J.What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent? J Natl Cancer Inst, 1990;82: 4

　　3　Plate K H, Breier G, Weich H A et al. Up-regulation of vascular endothelial growth factor and its cognate receptors in a rat glioma model of tumor angiogenesis. Cancer Resarch, 1993; 53: 5822

　　4　Folkman J.Angiogenesis. J Biol Chem, 1992; 267: 10931

　　5　Denekamp J. Angiogenesis, neovascular proliferation and vascular pathophysiology as targets for cancer therapy. Br J Radiol, 1993;66: 181

　　6　Noel W,Peter R C,Jonathan F et al. Tumor angiogenesis correlates with metastasis in invasive prostate carcinoma.Am J Pathol,1993;143:401

　　7　马大龙,庞　建，周保宏et al. 制备性SDS-PAGE法纯化人重组IL-3.中国免疫学杂志, 1990; 6(3): 182

　　8　杨小平, 陈国芬，张英珊et al. 人脐静脉内皮细胞培养及形态观察.中华心血管病杂志, 1988; 16(5):298

〔收稿1997-10-24　修回1998-03-10〕