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雷公藤内酯醇诱导人淋巴细胞凋亡的作用与细胞周期的关系
中国免疫学杂志 1999年第10期第15卷 中医中药与免疫
作者：刘栋 杨俊伟 陈朝红 戴春笋 刘志红 黎磊石
单位：南京军区南京总医院南京大学医学院，南京210002
关键词：雷公藤内酯醇；细胞凋亡；细胞周期
摘 要 目的：通过观察雷公藤内酯醇诱导淋巴细胞发生凋亡与细胞周期的关系，探讨该化合物导致细胞凋亡作用的机制。方法：以人外周血T细胞为研究对象，选择流式细胞分析术、DNA凝胶电泳及DNA片段测定等作为检测细胞凋亡的方法。结果：雷公藤内酯醇只能造成活化的T细胞发生细胞凋亡，且与雷公藤内酯醇的浓度正相关；雷公藤内酯醇诱导活化T细胞发生细胞凋亡的作用与细胞活化的程度密切相关；细胞周期分析结果表明，雷公藤内酯醇只能造成S+G2/M期细胞发生细胞凋亡，却不能导致G0/G1期细胞发生细胞凋亡。结论：雷公藤内酯醇诱导淋巴细胞发生细胞凋亡的作用与其所处的细胞周期密切相关。
中国图书分类号 R285.6
Relationship between cell cycle and apoptosis of activated T lymphocyctes
induced by triptolide
LIU Dong , YANG Jun-Wei, CHEN Zhao-Hong et al.
Research Institute of Nephrology,Jinling Hospital, School of Medicine,Nanjing University,Nanjing 210002
Abstract Objective:In order to explored the mechanisms of triptolide-induced apoptosis,the relationship between cell cycle and apoptosis of activated T cell induced were studied.Methods:Human peripheral T cells were stimulated with mitogen.To test the susceptibility to cell death by triptolide whether resulted from the process of coninuous cell cycling or ,alternatively,from the entry into a vulnerable stage of the cell cycle,T cell were cultured with agent that the cell at different stages.For the cell cycle analysis,cells were collected and stained with propidium iodide,then analyzed with a flow cytometer(EPICS XL,Coulter).In addition,apoptosis was confirmed with DNA fragmentation and membrane damage.Results:The degree of susceptibility to apoptosis correlated with the level of cell cycling as measured by thymidine incorporation during S phase;and DNA fragmentation associated with entry into S phase.The number of cells in S phase was proporational to amount of apoptotic cell induced by triptolide.Prevention of cell death correlated with delayed entry into S phase from G1 following triptolide added.Treatment of activative T cell with dBcAMP or forskolin,which block primary activated T cells in G1 phase ,also inhibited triptolide-induced cell death.In contrast,the DNA synthesis inhibitor aphidicolin arrested activated T cell cycle pregression in S phase and failed to prevent the apoptotic cell death.Conclusion:Triptolide-induced apoptosis of activated T cells is cell cycle dependent,and this may be one of the mechanisms of triptolide for the immune system.
Key words Triptolide Apoptosis Cell cycle
凋亡是独具细胞形态和变化并有重要生物学意义的细胞死亡方式。作者以往的研究已证实，雷公藤内酯醇只能造成已活化的淋巴细胞发生细胞凋亡［1］。作者假设雷公藤内酯醇诱导淋巴细胞发生凋亡的作用可能与细胞的周期相关。因此，本文应用流式细胞术以及DNA凝胶电泳和DNA片段测定等方法，观察雷公藤内酯醇促使活化的淋巴细胞凋亡的作用与细胞周期的关系，以进一步了解雷公藤内酯醇的作用机理。
1 材料与方法
1.1 试剂 雷公藤内酯醇纯品由中国医学科学院皮肤病研究所提供。样品经高效液相层析分析，归一化法计算，其纯度大于99%。雷公藤内酯醇于实验前以DMSO新鲜配制，微孔滤膜(0.22 μm)除菌待用。RPMI 1640(GIBCO)培养液中，含10%灭活小牛血清(四季青生物工程技术研究所，杭州)，L-谷酰胺(2 mmol/L)，2-巯基乙醇(10 mmol/L)，HEPES及青、链霉素各100 U/ml。人类重组白介素-2(rhIL-2)购自南京军区医学研究所，植物血凝素A(PHA-P)和佛波脂(PMA)均购自Sigma公司(美国)。
1.2 人外周血T细胞 淋巴细胞分离液制备健康成人外周肝素抗凝血中的淋巴细胞，再以T细胞分离剂(LK05TD，One Lambda Inc.，美国)分离其中的T细胞，经流式细胞仪检测T细胞纯度＞95%。以含10%灭活小牛血清的RPMI1640配成T细胞悬液(1×106 ml-1)。将PHA-P(5 μg/ml)和PMA (2 ng/ml)加入上述的T细胞悬液中，37℃、5%CO2培养48 h，换液并改加含rhIL-2(50 U/ml)和PHA-P(5 μg/ml)的RPMI 1640(10%FCS)培养液，细胞浓度为5×105 ml-1，继续培养48～72 h后用于实验。
1.3 流式细胞术 参考文献［2］，取待检测细胞(1×106 ml-1)，加入1.5 ml低渗溴化丙啶染液(PI 50 μg/ml溶于0.1%枸椽酸钠和0.1%TritonX-100溶液中)于15×75多聚乙烯管中，4℃避光过夜后，进行流式细胞术(Epics XL型流式细胞仪，Coulter Co.，USA)分析，按100 cells/s计数104个细胞，根据二倍体及亚二倍体峰分析细胞周期和细胞凋亡。
1.4 DNA片段的测定和DNA凝胶电泳 参考文献［3］方法，提取细胞内DNA，分别采用二苯胺测定和凝胶电泳方法，观察所提取的细胞内总DNA片段和电泳区带的变化。
1.5 T细胞增殖的测定 参考文献［4］方法，以3H-TdR掺入率表示细胞的增殖反应。
1.6 统计学处理 以均数±标准差表示实验结果，t检验分析各组间的差异，P＜0.05为统计学差异显著。线性回归方法分析雷公藤内酯醇诱导活化T细胞凋亡的作用与细胞周期的关系［5］。
2 结果
2.1 有丝分裂原刺激下T细胞增殖与细胞周期的关系 如表1所示，98%的新鲜T细胞处于G0/G1期(见图1A)，随着PHA-P浓度的增加，G0/G1期的T细胞数逐渐减少，S期T细胞数增多。10 μg/ml的PHA-P作用48 h后，约有31%～35%的细胞处于S期，5%～7%左右的细胞进入G2/M期(见图1B)。同时，其3H-TdR的掺入量也随PHA-P浓度的升高而增加，与细胞周期中S期细胞数量的变化相一致。
由表2可知，有丝分裂原作用12 h后，只有不足3%的T细胞进入S期。随着有丝分裂原与T细胞作用时间的延长，S期细胞数逐渐增多，同时3H-TdR掺入率也相应增加。
2.2 雷公藤内酯醇诱导活化T细胞凋亡的作用 如图1所示，雷公藤内酯醇(20 ng/ml)造成T细胞凋亡的数量随PHA-P(1～10 μg/ml)浓度的增加而逐渐增多(见图2A)。0.2 μg/ml PHA-P时凋亡细胞数最少(3.6%)，PHA-P为10 μg/ml时出现的凋亡细胞最多(27.8%，见图1C)。图3是以100 bp阶梯的分子量标准为标尺、雷公藤内酯醇促使活化T细胞凋亡的DNA凝胶电泳照片和DNA片段。
图1 细胞周期及雷公藤内酯醇造成活化T细胞凋亡的流式细胞术分析结果
Fig.1 The analysis of cell cycle and apoptosis for human peripheral T lymphocytes treated with PHA-P or triptolide
Note：A.cell cycle of freshly isolated human peripheral T lymphocytes;B.cell cycle of T lymphocytes treated with PHA-P(10 ng/ml) for 48 h.C.cell cycle of T lymphocytes treated with PHA-P (10 ng/ml) and triptolide (20 ng/ml) together
表1 不同浓度PHA-P所致人T细胞增殖周期的变化
Tab.1 The alteration of cell cycle for human peripheral T lymphocytes treated with different ambient of PHA-P for 48 h
| PHA-P(μg/ml) | Cell cycle | 3H-TdR incorporation | ||
| G0/G1 phase | S phase | G2/M phase | cpm value | |
| 0 | 98.2% | 1.1% | 0.1% | 1 302±210 |
| 0.20 | 94.8% | 5.2% | 0.0% | 2 816±823 |
| 0.50 | 92.1% | 7.7% | 0.2% | 3 241±1001 |
| 1.25 | 86.0% | 12.3% | 1.7% | 5 826±1 606 |
| 3.75 | 74.0% | 23.2% | 2.8% | 8 072±2 069 |
| 10.00 | 62.2% | 32.7% | 5.1% | 10 625±3 187 |
Note:PMA (2 ng/ml) and rhIL-2(50 μg/ml) were added into media at the same time
表2 不同时间有丝分裂原作用后人T细胞周期和3H-TdR掺入量的变化
Tab.2 The alteration of cell cycle for human peripheral T lymphocytes stimulated with PHA-P for 12,24,48,72 or 96 h
| Time(h) | Cell cycle | 3H-TdR incorporation | ||
| G0/G1 phase | S phase | G2/M phase | cpm value | |
| 0 | 98.2% | 1.1% | 0.1% | 1 302±210 |
| 12 | 97.8% | 2.2% | 0.0% | 2 006±713 |
| 24 | 94.1% | 5.8% | 0.1% | 2 941±900 |
| 48 | 89.0% | 9.4% | 1.6% | 4 729±1 026 |
| 72 | 78.0% | 20.1% | 1.9% | 7 302±1 101 |
| 96 | 69.1% | 24.9% | 6.0% | 9 508±2 471 |
| 120 | 52.0% | 37.8% | 10.2% | 14 952±3 708 |
Note:PHA-P(5 ng/ml),PMA(2 ng/ml) and rhIL-2(50 U／ml) were added into media at the same time
图2 雷公藤内酯醇诱导活化的T细胞发生细胞凋亡的作用
Fig.2 Cell apoptosis was induced in activated T lymphocyte with triptolide
Note：A.the gel electrophoresis of DNA extracted from activated T lymphocytes treated with triptolide,lane 1:T lymphocytes from Balb/c mouse treated with dexamethasone was exhibited a specific "DNA ladder" manner in gel electro phoresis,lane 2:cells treated with triptolide,lane 3:DNA molecular marker (100 bp);B.the analysis of DNA fragment of activated T lymphocytes treated with triptolide
实验同时观察了相同浓度有丝分裂原刺激后，不同时间收集的T细胞对雷公藤内酯醇诱导细胞凋亡的反应。结果表明，雷公藤内酯醇几乎不能造成有丝分裂原刺激12 h后的T细胞发生凋亡。随着有丝分裂原与T细胞作用时间的延长，雷公藤内酯醇作用后，T细胞凋亡的数量则呈逐渐增多的趋势。雷公藤内酯醇作用于有丝分裂原刺激24 h后的T细胞凋亡细胞数为5.2%；雷公藤内酯醇导致48、72、96及120 h后的T细胞细胞凋亡分别为11.6%、23.1%、30.9%和42.5%(见图2B)。
此外，在上述两种实验条件下，未加雷公藤内酯醇对照组的T细胞中，凋亡细胞数均小于3.0%(见图2A和图2B)。
2.3 雷公藤内酯醇诱导活化T细胞凋亡的作用与细胞周期的关系 结合有丝分裂原刺激下T细胞周期的变化和雷公藤内酯醇所致的凋亡细胞数，应用线性回归的方法，进一步分析雷公藤内酯醇诱导T细胞凋亡的作用与细胞周期的关系。结果表明，有丝分裂原浓度的增加使得T细胞中处于S期和G2/M期的细胞数明显增多，此时，雷公藤内酯醇(20 ng/ml)造成的凋亡细胞数也逐渐增多(如图4A所示)。线性回归分析表明，雷公藤内酯醇所致凋亡细胞数与S期+G2/M期细胞数呈正相关(如图4B所示)，与G0/G1期细胞数呈负相关。
同样，随着有丝分裂原刺激T细胞时间的延长，T细胞中S期+G2/M期细胞数也逐渐增多。雷公藤内酯醇作用于不同时间的T细胞，其凋亡细胞数也逐渐增加。线性回归分析表明，此时凋亡细胞数仍与S期+G2/M期细胞数呈正相关，与G0/G1期细胞数呈负相关。
图3 雷公藤内酯醇诱导活化T细胞凋亡作用
Fig.3 The dose relationship and time-course for apoptosis induced by triptolide in activated T lymphocyte.
Note:A:triptolide was revealed a dose-dependent manner in inducing T lymphocyte apoptosis；B.the time-course for apoptosis induced by triptolide
图4 雷公藤内酯醇促使活化T细胞凋亡与细胞周期的关系
Fig.4 The relationship between cell cycle and apoptosis of activated T lymphocytes induced by triptolide
3 讨论
细胞凋亡是具有独特细胞形态和生物化学变化的细胞死亡方式，同时受到其自身基因的调控。无论在维持机体免疫系统功能的稳定，还是免疫性疾病的发生中，细胞凋亡都有重要的作用［6］。检测细胞凋亡的方法有多种，其中以细胞形态学变化为基础建立的定量检测方法最为可靠。此外，根据细胞凋亡时DNA特征性变化而建立的DNA片段检测和DNA凝胶电泳技术，也是判断细胞凋亡的常用检测方法［7］。因此，实验中选用的检测细胞凋亡的方法是可靠的，本文不仅观察并证实了雷公藤内酯醇能够诱导活化的人外周血T细胞发生细胞凋亡，同时还对雷公藤内酯醇诱导活化T细胞发生细胞凋亡的作用以及与细胞周期的关系进行了定量分析。
雷公藤内酯醇是抑制淋巴细胞生长作用最强的雷公藤二萜化合物［8］，作者以往的研究已证明，雷公藤内酯醇能够造成已活化的淋巴细胞发生细胞凋亡。本文又进一步证实此作用与S+G2/M期细胞呈正相关，与G0/G1期细胞负相关，说明雷公藤内酯醇造成淋巴细胞凋亡的作用与细胞周期密切相关。目前已知多种因素能够诱导细胞发生凋亡，其中包括γ辐射、细胞内Ca2+浓度升高、抗代谢药物——地塞米松和炎性细胞因子TNFα和TNFβ等［9］。此类诱导细胞凋亡作用的特点之一是在其造成淋巴细胞发生细胞凋亡时与细胞所处的细胞周期无关。尽管雷公藤内酯醇也能诱导淋巴细胞发生细胞凋亡，但是与上述诱导细胞凋亡作用不同的是，雷公藤内酯醇只能诱导增殖期(S+G2/M期)细胞发生细胞凋亡，说明雷公藤内酯醇促使细胞凋亡的作用具有明显的细胞周期选择性。
一个完整的细胞周期由G0、G1、S、G2和M期组成。抗原或有丝分裂原的作用，能够使静止期淋巴细胞G0期进入G1期，活化的细胞通过G1/S期的限制点后，在S期复制DNA，通过G2间期后，在M期分裂成两个子细胞。处于不同细胞周期的淋巴细胞其功能状态有显著的差异［10］，雷公藤内酯醇造成S+G2/M期细胞凋亡，对G0/G1期细胞无作用，说明细胞活化和增殖相关的细胞内生物化学变化，可能与雷公藤内酯醇诱导细胞凋亡作用密切相关，这为以后研究雷公藤内酯醇促使细胞凋亡作用机理的研究提供了重要实验基础。
作者简介：刘 栋，男，26岁，主要从事细胞生物学方面的研究；
指导教师，杨俊伟，37岁，博士生，主要从事移植免疫学研究
参考文献
1 杨俊伟，陈朝红，刘志红 et al.雷公藤内酯醇通过细胞凋亡阻止人T细胞增殖.肾脏病与透析肾移植杂志，1997；6(6)：205
2 Nicoletti I，Migliorati G， Pagliacci M C et al.A rapid and simple method for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide staining annd flow cytometry.J Immunol Methods，1991;139:271
3 Emlen W,Niebur J,Kadera R.Accelerated us in vitro apoptosis of lymphocytes from patients with systemic lupus erythematosus.J Immunol,1994;152:3685
4 McCulloch J,Martin S J.Assays of cellular activity.In：Delves P J eds.Cellular Immunology.New York:：BIOS Scientific Publishers Ltd,1994:95
5 孙瑞元.药理实验设计及统计分析.见：徐叔云，卞如濂，陈 修主编.药理实验方法学.第2版.北京：人民卫生出版社，1994：172
6 杨俊伟，黎磊石.程序化细胞死亡与疾病的关系.肾脏病与透析肾移植杂志，1995；4(3)：202
7 胡庆柳，丁振华.流式细胞术在细胞凋亡研究中的应用.细胞生物学杂志，1997；19(4)：199
8 Tao X L,Davis L S,Hashimoto K et al. The Chinese herbal remedy,T2,inhibits mitogen-induced cytokine gene transcription by T cells,but not initial signal transduction. J Pharmacol Exp Ther,1995;276:316
9 Thompson C B.Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease.Science,1995;267:1456
10 Boehme S A,Lenardo M J.Propriocidal apoptosis of mature T lymphocytes occurs at S phase of the cell cycle.Eur J Immunol,1993;23:1552
收稿1998-05-08 修回1998-10-26