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小檗碱对淋巴细胞与血管内皮细胞粘附及粘附分子的影响
中国免疫学杂志 1999年第11期第15卷 学术会议优秀论文选登
作者：郝 钰 邱全瑛 吴 砶 王娟娟
单位：北京中医药大学微生物与免疫学教研室，北京 100029
关键词：小檗碱；淋巴细胞；血管内皮细胞；粘附分子
中国图书分类号 R392.11 R285.5
摘 要 目的：通过研究小檗碱对淋巴细胞与血管内皮细胞粘附及粘附分子的影响，探讨小檗碱免疫抑制作用机制。方法：以小檗碱处理人淋巴细胞或人脐静脉内皮细胞(HUVEC)后，用蛋白染料染色法研究对淋巴细胞与内皮细胞粘附的作用，用细胞ELISA、免疫细胞化学染色法研究对细胞表面粘附分子表达的影响。结果：小檗碱能抑制静息的及IL-1、TNF激活的内皮细胞与淋巴细胞间的粘附，其主要分子机制为下调内皮细胞表面粘附分子ICAM-1的表达；小檗碱能抑制IL-1激活的淋巴细胞与内皮细胞的粘附,对淋巴细胞表面粘附分子CD18的表达无影响。结论：通过抑制细胞表面粘附分子的表达而抑制淋巴细胞与内皮细胞的粘附，从而抑制淋巴细胞再循环可能是小檗碱发挥免疫抑制作用的机制之一。
Effect of berberine on lymphocyte-endothelium adhesion and adhesion
molecules expression
HAO Yu, QIU Quan-Ying,WU Jun et al
(Department of Immunology,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029)
Abstract Objective：To investigate the effect of berberine on lymphocyte-endothelium adhesion and cell adhesion molecules(CAMS).Methods：Based on the model of human umbilical vein endothelial cell(HUVEC),this study adopted Rose Bengal Stain, cell ELISA, immunocytochemistry techniques to investigate the effect of berberine on lymphocyte-endothelium adhesion and the molecular mechanism.Results：Berberine inhibited HUVEC adhesion for lymphocyte when pretreated HUVEC and antagonised IL-1 and TNF-induced upregulation of HUVEC adhesion for lymphocyte.Meanwhile,IL-1-stimulated lymphocyte adhesion to HUVEC was diminished in the presence of berberine.The main molecular mechanism of berberine's function may be downregulating the expression of ICAM-1 on the HUVEC .Conclusion：It is one of the mechanisms of immunosuppression of berberine that it inhibite lymphocyte -endothelium adhesion by downregulating the CAMs expression to inhibite lymphocyte recirculation.
Key words Berberine Lymphocyte HUVEC Adhesion molecule
小檗碱是中药黄连、黄柏的主要生物碱，具有多方面的药理作用，主要有抗菌、抗炎、抗癌等。我们的前期研究及文献资料表明，小檗碱具有免疫抑制作用。近年来，淋巴细胞与血管内皮细胞间的粘附在淋巴细胞再循环及免疫应答中的作用日益受到重视。本研究从小檗碱影响淋巴细胞与血管内皮细胞粘附的角度探讨小檗碱免疫抑制作用的机制。
1 材料与方法
1.1 药品与试剂 小檗碱（Berberine,C20H18O4N+中国药品生物制品检定所)，内皮细胞生长因子(ECGF德国 B.M)，Ι型胶原酶(美国 SIGMA)，淋巴细胞分层液(天津中国医学科学院血液病研究所)，鼠抗人ICAM-1单克隆抗体(美国 ZYMED)，鼠抗人CD18单克隆抗体、重组IL-1、重组TNF 、APAAP试剂盒(邦定生物医学公司)。
1.2 实验方法
1.2.1 人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的培养与鉴定［1］ 以0.1%胶原酶消化法分离内皮细胞，用完全M199（含20％FCS，20 μg/ml ECGF）接种细胞于培养瓶(预先用1%明胶包被)，置37℃ 5%CO2孵箱培养，当细胞融合成单层时，以0.125％胰酶-0.02%EDTA消化传代，实验用第3～5代。用第Ⅷ因子相关抗原检测(SP免疫细胞化学染色法)阳性鉴定内皮细胞。
1.2.2 制备人外周血淋巴细胞 常规分离出单个核细胞层，用RPMI1640培养，37℃ 5%CO2孵育48 h供用。
1.2.3 淋巴细胞与内皮细胞粘附实验［2］ 用药物处理呈单层的内皮细胞或淋巴细胞20 h后进行细胞粘附实验，每组3复孔。内皮细胞中加入淋巴细胞3×105～5×105个细胞/孔，37℃ 5%CO2孵育1 h，用PBS洗去未粘附细胞，加入0.25%虎红，100 μl/孔，室温作用10 min，洗去游离虎红，加PBS-乙醇(1:1)200 μl/孔，室温作用1 h后，酶标仪570 nm测A值。最后用实验孔A值减去空白孔(未加淋巴细胞)A值表示粘附量。①小檗碱处理内皮细胞或淋巴细胞后进行粘附实验；②小檗碱加IL-1处理内皮细胞或淋巴细胞后进行粘附实验；③小檗碱加TNF处理内皮细胞或淋巴细胞后进行粘附实验。
1.2.4 内皮细胞表面ICAM-1表达的检测［3］ 用细胞ELISA法，经上述药物处理内皮细胞 20 h后，PBS洗2遍，进行细胞ELISA实验：用4％多聚甲醛于4℃固定40 min后，以2％BSA-PBS 200 μl/孔封闭40 min，然后加入鼠抗人ICAM-1单抗50 μl/孔（用0.1%BSA-PBS稀释 1：200），37℃孵育1 h后加入酶标羊抗鼠IgG抗体100 μl/孔（1：2 000稀释），37℃孵育1 h后加入邻苯二胺底物液200 μl/孔，室温避光15 min，2 mol/L H2SO4 50 μl/孔中止反应，酶标仪492 nm测A值。每步都用0.05％Tween20-PBS洗板3次。
1.2.5 淋巴细胞CD18表达的检测 用APAAP法。用不同药物处理淋巴细胞20 h后，用离心涂片机制备细胞涂片（每组3张片），用APAAP法检测。 显微镜下计数200个淋巴细胞，计算阳性细胞百分率。
1.3 统计学处理 t检验。
2 结果
2.1 小檗碱对淋巴细胞与内皮细胞间粘附的影响 表1结果表明，小檗碱处理内皮细胞后，可抑制其与淋巴细胞间的粘附，与对照组比较有明显差异，且有剂量依赖趋势；小檗碱处理淋巴细胞后，对其与内皮细胞的粘附无明显作用。
表1 小檗碱对淋巴细胞与内皮细胞间粘附的影响
Tab.1 Effect of berberine on lymphocyte-endothelium adhesion
| Group | Dose | EC-LC adhesion | LC-EC adhesion |
| (μg/ml) | A value( | A value( | |
| (pretreat EC) | (pretreat LC) | ||
| Control | 0.039 7±0.006 4 | 0.069 7±0.005 9 | |
| Berberine | 0.32 | 0.027 3±0.003 81) | 0.065 3±0.012 9 |
| 1.60 | 0.020 3±0.004 51) | 0.061 3±0.009 6 | |
| 8.00 | 0.014 0±0.004 62) | 0.063 3±0.004 5 |
Note：1) P ＜ 0.05 compared with controls; 2) P ＜ 0.01 compared with controls, EC: endothelial cell,LC:lymphocyte
表2 小檗碱对IL-1刺激的淋巴细胞与内皮细胞粘附的影响
Tab.2 Effect of berberine on IL-1 induced lymphocyte-endothelium adhesion
| Group | Dose | EC-LC adhesion | LC-EC adhesion |
| (μg/ml) | A value( | A value( | |
| (pretreat EC) | (pretreat LC) | ||
| Control | 0.019 0±0.007 0 | 0.032 0±0.005 4 | |
| IL-1 | 1 000 U/ml | 0.041 7±0.008 11) | 0.042 3±0.003 51) |
| IL-1+B | 0.32 | 0.035 3±0.003 1 | 0.032 7±0.006 2 |
| 1.60 | 0.026 0±0.004 62) | 0.030 3±0.006 02) | |
| 8.00 | 0.020 7±0.005 23) | 0.029 0±0.003 53) |
Note：1)P＜0.05 compared with controls； 2)P＜0.05 compared with IL-1； 3)P＜0.01 compared with IL-1，B:Berberine2.2 小檗碱对IL-1刺激的淋巴细胞与内皮细胞粘附的影响 表2结果表明，IL-1处理内皮细胞后能显著增强其与淋巴细胞间的粘附，小檗碱可抑制IL-1的作用；经IL-1处理的淋巴细胞能明显增强与内皮细胞的粘附，小檗碱亦可抑制其作用。
表3 小檗碱对TNF刺激的淋巴细胞与内皮细胞粘附的影响
Tab.3 Effect of berberine on TNF induced lymphocyte-endothelium adhesion
| Group | Dose | EC-LC adhesion | LC-EC adhesion |
| (μg/ml) | A value( | A value( | |
| (pretreat EC) | (pretreat LC) | ||
| Control | 0.033 3±0.003 5 | 0.042 3±0.007 1 | |
| TNF | 1 000 U/ml | 0.074 0±0.006 11) | 0.047 0±0.005 6 |
| TNF+B | 0.32 | 0.059 7±0.006 4 | 0.036 7±0.004 2 |
| 1.60 | 0.047 3±0.004 82) | 0.035 7±0.006 9 | |
| 8.00 | 0.036 0±0.006 12) | 0.035 2±0.004 6 |
Note：1) P＜0.01 compared with controls；2)P＜0.01 compared with TNF2.3 小檗碱对TNF刺激的淋巴细胞与内皮细胞粘附的影响 表3结果表明，TNF处理内皮细胞能明显促进其与淋巴细胞间的粘附，小檗碱高、中剂量组与TNF共同处理内皮细胞可抑制TNF的作用。TNF处理的淋巴细胞未见与内皮细胞粘附增加，小檗碱与TNF共同处理淋巴细胞与TNF单独处理淋巴细胞无明显差异。
表4 小檗碱对内皮细胞表面ICAM-1表达的影响
Tab.4 Effect of berberine on the expression of ICAM-1 on the HUVEC
| Group | ICAM-1
A value ( |
P |
||
| 1 | Control | 0.084 0±0.006 0 | ||
| 2 | B(8μg/ml) | 0.059 0±0.008 1 | 2∶1 | P＜ 0.05 |
| 3 | TNF(1000U/ml) | 0.209 0±0.005 5 | 3∶1 | P＜ 0.01 |
| 4 | TNF+ B(8μg/ml) | 0.172 0±0.011 5 | 4∶3 | P＜ 0.05 |
| 5 | IL-1(1000U/ml) | 0.170 7±0.003 8 | 5∶1 | P＜ 0.01 |
| 6 | IL-1+ B(8μg/ml) | 0.145 0±0.002 1 | 6∶5 | P＜ 0.05 |
2.4 小檗碱对内皮细胞表面ICAM-1表达的影响 表4结果表明，小檗碱能减少内皮细胞表面ICAM-1的表达，IL-1、TNF均能增加内皮细胞表面ICAM-1的表达，而小檗碱可抑制IL-1和TNF的增强作用。
2.5 小檗碱对淋巴细胞表面CD18表达的影响 用APAAP法进行免疫细胞化学染色后计数淋巴细胞CD18阳性百分率显示，小檗碱、TNF均对淋巴细胞CD18阳性百分率无影响， IL-1可增加CD18阳性淋巴细胞百分率，小檗碱未抑制IL-1的作用(表5)。
表5 小檗碱对淋巴细胞表面CD18表达的影响
Tab.5 Effect of berberine on the expression of CD18 on the lymphocyte
| Group | LC CD18+%( | P | ||
| 1 | Control | 49.00±2.31 | ||
| 2 | B(8 μg/ml) | 50.67±2.05 | 2∶1 | P＞ 0.05 |
| 3 | TNF(1 000 U/ml) | 49.33±2.87 | 3∶1 | P＞ 0.05 |
| 4 | TNF+ B(8 μg/ml) | 48.67±2.35 | 4∶3 | P＞ 0.05 |
| 5 | IL-1(1 000 U/ml) | 61.33±3.25 | 5∶1 | P＜ 0.01 |
| 6 | IL-1+ B(8 μg/ml) | 58.33±2.87 | 6∶5 | P＞ 0.05 |
3 讨论 在淋巴细胞再循环过程中，淋巴细胞通过精细的分子调节机制与血管内皮细胞相互作用，归巢到淋巴和淋巴样组织，为机体提供了能不断监视抗原侵入的免疫细胞，同时也有利于淋巴细胞与其他免疫细胞的相互作用，从而扩大免疫反应。淋巴细胞再循环的重要环节就是血液中的淋巴细胞与淋巴结、集合淋巴结或脾脏的毛细血管后静脉HEV及其类似结构粘附，继而渗出血管进入淋巴组织［4］。现已证明细胞间粘附的分子基础是细胞表面众多粘附分子的相互作用，在免疫反应发生时，体内产生大量IL-1、TNF等细胞因子，上调细胞表面粘附分子的表达［5］，促进淋巴细胞与血管内皮细胞的粘附，从而进一步促进免疫反应。本研究结果显示，小檗碱能抑制静止的及IL-1、TNF激活的内皮细胞与淋巴细胞的粘附，亦可抑制IL-1激活的淋巴细胞与血管内皮细胞的粘附，提示小檗碱可通过抑制淋巴细胞与内皮细胞的粘附而抑制淋巴细胞再循环，减少淋巴细胞与抗原的接触机会，从而抑制免疫反应，抑制机体免疫功能。此外，内皮细胞作为抗原呈递细胞与T细胞接触可为T细胞活化提供重要的共刺激信号，参与免疫应答进程［6］。因而，小檗碱对淋巴细胞与内皮细胞粘附的作用也影响免疫应答时T细胞的活化。
本研究检测了在淋巴细胞与内皮细胞稳定粘附中起主要作用的粘附分子ICAM-1和CD18的表达。结果表明小檗碱可下调静止的及IL-1、TNF激活的内皮细胞表面ICAM-1的表达,与粘附实验结果相符,说明抑制内皮细胞ICAM-1的表达是小檗碱抑制淋巴细胞与内皮细胞粘附的分子机制之一。小檗碱可减少IL-1所致的细胞粘附增加，但未减少IL-1导致的CD18表达增多。淋巴细胞与内皮细胞的粘附有除CD18-ICAM-1以外的粘附分子介导，如VLA-4与VCAM-1等［7］，所以小檗碱可能还通过抑制其他粘附分子的表达而抑制细胞粘附；也可能通过使淋巴细胞CD11/CD18的构型改变而减弱与内皮细胞的亲和力［8］。以上均有待于进一步研究证实。
①本课题由卫生部科研基金(No.94-2-188)资助
作者简介：郝 钰，女，34岁，硕士，讲师，从事中药免疫调节作用研究；
指导教师，邱全瑛，女，60岁，博士生导师，教授，从事中药免疫调节作用研究
4 参考文献
1 Jaffe E A.Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins.Identification by morphologic and immunologic criteria.J Clin Invest,1973;52:2745
2 Gamble J R，Vadas M A. A new assay for the measurement of the attachment of neutrophils and other cell types to endothelial cells.J Immunol Method,1988;109:175
3 Teresa Krakauer.A sensitive ELISA for measuring the adhesion of leukocytic cells to human endothelial cells.J Immunol Meth,1994;177:207
4 Pals T， Horst E， Scheper R J et al.Mechanisms of human lymphocyte migration and their role in the pathogenesis of disease.Immunological Reviews,1989;108:111
5 Dustin M L, Rothlein R,Bhan A K et al.Induction by IL-1 and IFN:tissue distribution,biochemistry,and function of a natural adherence molecule(ICAM-1).J Immunol,1986;137(1):245
6 Johannes Pammer ,Andreas Plettenberg,Wolfgang Weninger et al.CD40 antigen is expressed by endothelial cells and tumor cells in Kaposi'Sarcoma.J of Pathol,1996;148(5):1387
7 Meerschaert J, Furie M B.Monocytes use either CD11/CD18 or VLA-4 to migrate across human endothelium in vitro.J Immunol,1994;152(4):1915
8 Gahmberg C G.Leukocyte adhesion basic and clinical aspects.Amsterdam:Elsevier Science Publishers B.V,1992:165-181
收稿1998-05-05 修回1999-06-10