辅佐细胞在磷酸一乙脂激活γδT细胞中的作用①

辅佐细胞在磷酸一乙脂激活γδT细胞中的作用①

中国免疫学杂志 2000年第1期第16卷 分子与细胞免疫学

作者：黄岚　葛锡锐

单位：黄　岚(中国科学院上海细胞生物学研究所　上海 200031)；葛锡锐(中国科学院上海细胞生物学研究所　上海 200031)

关键词：γδT细胞；磷酸一乙脂；辅佐细胞

　　摘　要：目的：研究辅佐细胞在非肽类抗原MEP激活γδT细胞中的作用及机制。方法：用花环沉降法分离出正常人外周血中的T细胞，通过细胞计数和FACS，观察MEP激活γδT细胞时辅佐细胞的作用。结果：MEP激活γδT细胞需要有IL-2的持续存在。MEP和IL-2联合作用于T细胞可少量激活其中的γδT细胞，但与IL-2的单独作用无明显差异。加入辅佐细胞能大大促进MEP和IL-2联合激活γδT细胞的作用，且明显强于IL-2的单独作用。辅佐细胞分泌的上清对MEP激活γδT细胞无明显促进作用。结论：MEP激活γδT细胞需要辅佐细胞的参与，可能主要通过与T细胞间的直接接触而起作用。

　　分类号：R371.4

Role of accessory cells in the activation of γδT cells induced by monoethyl phosphate

HUANG Lan

　　Shanghai Institute of Cell Biology,Chinese Academy of Sciences,Shanghai 200031

　　GE Xi-Rui

　　Shanghai Institute of Cell Biology,Chinese Academy of Sciences,Shanghai 200031

　　Abstract：Objective：Study of the role of accessory cells in the activation of γδT cells by nonpeptidic antigen monoethyl phosphate(MEP).Methods： T cells from peripheral blood of healthy donors have been isolated by means of E-rosette,then the cellular requirement for the proliferation of γδT cells activated by MEP has been investigated by flow cytometry.Results： The continuous presence of IL-2 was required for the proliferation of γδT cells in response to MEP.The combination of IL-2 and MEP stimulated a few of γδT cells among the whole T cells,but the expansion had no significant difference compared with IL-2 alone.However,the addition of accessory cells obviously enhanced the proliferation of γδT cells induced by MEP and IL-2,and the effect was obviously greater than that by IL-2 alone.The supernatant of accessory cells had no obvious effect on the expansion of γδT cells stimulated with MEP.Conclusion： Accessory cells are necesssary in the activation of γδT cells induced by MEP.Moreover,it is possible that accessory cells provide the necessary costimulatory factors for γδT cell proliferation by direct contact.

　　Key words：γδT cells　Monoethyl phosphate　Accessory cells▲

　　γδT细胞是人外周血中含量很少的一类T淋巴细胞，仅占1%～10%。非肽类的小分子磷酸化合物如磷酸一乙脂(monoethyl phosphate,MEP)等能选择性激活γδT细胞，但γδT细胞对这些配体的具体识别机制还不清楚。本研究旨在观察辅佐细胞在MEP激活γδT细胞中的作用，并对其作用机制进行初步探讨。

　　1　材料与方法

　　1.1　人外周血T淋巴细胞和辅佐细胞的分离　取7名健康成年人新鲜外周静脉血，肝素抗凝，用Ficoll-Hypaque分离出外周血单个核细胞。然后用2-aminoethyl-isothiunrnium bromide hydrobromide(AET,Sigma公司)处理的绵羊红细胞分离出T细胞(T)和非T细胞，非T细胞作为辅佐细胞(accessory cells,简称A)，用丝裂霉素C(Tokyo Kyowa公司)处理辅佐细胞(50 μg/10⁷ cells)使其丧失增殖能力。

　　1.2　细胞增殖实验

　　1.2.1　辅佐细胞对MEP 激活γδT细胞的作用　于24孔细胞培养板中每孔加入5×10⁵T细胞，实验组每孔再加入4×10⁵辅佐细胞，对照组加入培养液，各孔终体积为1 ml。培养液为含10%自体血清的RPMI1640，向各孔加入1 mmol/L MEP (Tokyo Kasei 公司)和40 U/ml IL-2(上海华新生物制品公司)刺激细胞增殖。同时，设只加MEP或IL-2的对照孔及MEP和IL-2共同处理的辅佐细胞孔。37℃，5%CO₂连续培养9 d，每3天半量换液，第9天时计数每孔细胞数并用流式细胞仪测定其中γδT细胞的百分含量(γδT细胞数=细胞总数×γδT细胞百分含量)。

　　1.2.2　不同浓度辅佐细胞对MEP激活γδT细胞的作用　于24孔细胞培养板中每孔加入5×10⁵T细胞，实验组每孔再加入不同浓度的辅佐细胞，对照组不含辅佐细胞，第9天时测定γδT细胞的数量。

　　1.2.3　辅佐细胞的条件培养液对MEP激活γδT细胞的作用　逐日将辅佐细胞孔的上清作为条件培养液加入T细胞孔，半量换液。辅佐细胞孔中补加含相同浓度MEP和IL-2的新鲜培养液。第9天时测定γδT细胞的数量。

　　1.3　细胞表型分析　采用直接荧光抗体染色，抗TCRγδ-PE单抗购自Pharmingen公司，抗CD3-FITC单抗和流式细胞分析仪(FACSC alibur)购自Becton Dickinson公司。

　　1.4　统计方法　采用student-t检验。2　结果2.1　T细胞的分离及辅佐细胞的处理　用花环沉降法分离的T细胞经流式细胞仪分析，CD3⁺细胞从(83.58±0.91)%提高到(95.00±2.04)%，有效地去除了单核细胞、B淋巴细胞等辅佐细胞。剩余的为少量CD3^-CD2⁺的NK细胞，对实验结果无明显影响。辅佐细胞经丝裂霉素C处理9 d后，细胞无明显增殖。

　　2.2　MEP激活T细胞时需要IL-2的持续存在　由图1可见，无论是T细胞还是T⁺辅佐细胞对MEP的单独作用都无反应。MEP和IL-2联合作用于T细胞可使其增殖作用稍强于IL-2的单独作用，但差别无显著性(P＞0.05)。MEP和IL-2联合作用于T⁺辅佐细胞时促进淋巴细胞增殖的作用强于IL-2的单独作用(P＜0.05)。以上结果表明MEP活化T细胞时需要IL-2的持续存在。

图1　IL-2对MEP激活T细胞的影响

　　Fig.1　The effect of IL-2 on the activation of T cells by MEP

　　Note:*P＞0.05 vs T(I);△P＜0.05 vs T+A(I);Abbreviations:M,MEP;I,IL-2

　　2.3　辅佐细胞促进MEP和IL-2对γδT细胞的增殖作用　从图2可见，MEP和IL-2联合作用于T细胞即可使其中少数γδT细胞活化增殖作用稍强于IL-2的单独作用，但无显著性差异(P＞0.05)。这表明MEP作用于T细胞不能使其中的γδT细胞增殖，而加入辅佐细胞后可使MEP和IL-2对γδT细胞的刺激作用明显增强(P＜0.01)。并且在有辅佐细胞存在时，MEP和IL-2促进γδT细胞增殖的作用明显强于IL-2的单独作用(P＜0.01)。这表明MEP刺激γδT细胞增殖的作用需要辅佐细胞的存在。而加入辅佐细胞后可使IL-2刺激γδT细胞增殖的作用有所增加，但无显著性差异(P＞0.05)。这证实了IL-2对γδT细胞的作用与辅佐细胞无关。

图2　辅佐细胞对MEP和IL-2激活γδT细胞的作用

　　Fig.2　The role of accessory cells in the activation of γδT cells by the combination of MEP and IL-2

　　Note:*P＜0.01,;△P＞0.05 vs T(M+I);△△P＜0.01，**P＞0.05 vs T+A(I)；Abbreviations:M,MEP;I,IL-2

　　2.4　辅佐细胞促进MEP和IL-2激活γδT细胞的浓度依赖性　图3结果显示随着辅佐细胞浓度的增加，其对MEP激活γδT细胞的促进作用不断增强。这表明辅佐细胞的作用有细胞浓度依赖性。

图3　不同数量的辅佐细胞对MEP激活γδT细胞的影响

　　Fig.3　The effect of different numbers of accessory cells on the activation of γδT cells by MEP

　　2.5　辅佐细胞分泌的上清对MEP激活γδT细胞无明显增强作用　如图4所示，以辅佐细胞分泌的上清为条件培养液的T细胞孔中，γδT细胞的增殖较单用MEP和IL-2培养的T细胞孔有所增强，但无显著性差异(P＞0.05)。而加入辅佐细胞的T细胞孔较加入条件培养液的T细胞孔，γδT细胞的增殖明显增强(P＜0.05)。因此辅佐细胞可能主要不是通过非细胞接触性方式发挥作用的。

图4　辅佐细胞上清对MEP激活γδT细胞的作用

　　Fig.4　The effect of the supernatant of accessory cells on the activation of γδT cells by MEP

　　Note:*P＜0.01,**P＞0.05 vs T;△P＜0.01 vs T+As (the supernatant of A)

　　3　讨论

　　γδT细胞是八十年代中期发现的一类新型T细胞。最近的研究发现MEP等非肽类小分子磷酸化合物可特异性激活γδT细胞^［1］，为γδT细胞的基础研究和临床应用提供了新的手段。我们的研究发现单用MEP不能使淋巴细胞活化增殖，需要有小剂量IL-2的协同作用。尽管单用IL-2可使γδT细胞有少量增殖，但远不及MEP和IL-2的联合作用。IL-2可能是给MEP激活的γδT细胞提供足够的生长因子，使其有效增殖。Elloso等认为γδT细胞对疟疾抗原的增殖反应需要两种信号，第一种信号是γδT细胞识别疟疾抗原提供的，第二种信号是作用于IL-2受体的细胞因子提供的^［2］。

　　我们实验室已成功地建立了MEP和IL-2共刺激γδT细胞的体外扩增体系，证实MEP可选择性扩增γδT细胞^［3］，但对MEP激活γδT细胞的具体机制还不了解。Boom等认为活结核杆菌激活CD4⁺T细胞和γδT细胞时需要辅佐细胞^［4］。Wesch等也认为IPP激活γδT细胞需要抗原递呈细胞和IL-2的参与^［5］。我们的研究发现MEP和IL-2联合作用于T细胞，可使其中少量的γδT细胞活化增殖，但与IL-2的单独作用无显著性差异。而加入辅佐细胞可明显促进MEP和IL-2引起的γδT细胞活化增殖。这提示MEP刺激γδT细胞活化增殖需要有辅佐细胞的参与。我们用不同的模型证实了非肽类抗原MEP激活γδT细胞需要有辅佐细胞的参与。但也有少数研究者得出了不同的结论。Lang等发现克隆的γδT细胞在缺乏抗原递呈细胞的情况下可直接对非肽类配体起反应，表现为细胞毒性和细胞因子产生^［6］。研究结论不一致可能是由于γδT细胞存在不同亚群，不同配体和不同递呈途径。

　　辅佐细胞促进非肽类抗原激活γδT细胞的具体机制还未完全阐明。目前认为非肽类抗原可能不需要辅佐细胞的加工和递呈^［7］。因此，辅佐细胞可能通过以下两种途径使MEP有效激活γδT细胞：一是辅佐细胞通过分泌多种细胞因子，促进T细胞的增殖。我们用辅佐细胞的上清作为条件培养液，观察到其虽可部分促进MEP对γδT细胞的激活，但与未加条件培养液者相比，无显著性差异。因此，辅佐细胞可能主要不是通过分泌活性因子起作用的。二是辅佐细胞表面表达B7分子等共刺激因子及ICAM-1等多种粘附分子，可提供共刺激信号使γδT细胞充分活化增殖^［8］。由本实验的初步结果，我们推测辅佐细胞可能主要是通过与γδT细胞的直接接触而提供活化γδT细胞所必需的共刺激信号，有关辅佐细胞作用的具体分子机制有待进一步研究。■

　　①本课题受世界实验室MCD-I I-IV计划资助

　　作者简介：黄　岚，女，28岁，博士生；

　　指导教师，葛锡锐，男，研究员，主要从事细胞免疫学和肿瘤免疫学研究

　　参考文献：

　　［1］Tanaka Y,Morita C,Tanaka Y et al. Natural and synthetic non-peptide antigens recognized by human γδT cells. Nature,1995;375(6527):155

　　［2］Elloso M M,Van der Heyde H C,Troutt A et al.Human γδT cell subset-proliferative response to malarial antigen in vitro depends on CD4⁺ T cells or cytokines that signal through components of the IL-2R.J Immunol,1996;157(5):2096

　　［3］Chen S H,OKi A,OHno T et al.Selective proliferation of human γδT cells in vitro.Cell Res,1996:6(2):177

　　［4］Boom W H,Chervenak K A,Mincek M A et al.Role of the mononuclear phagocyte as an antigen-presenting cell for human γδT cells activated by live Mycobacterium tuberculosis. Infect Immun,1992;60(9):3480

　　［5］Wesch D,Marx S,Kabelitz D.Comparative analysis of αβ and γδT cell activation by Mycobacterium tuberculosis and isopentenyl pyrophosphate. Eur J Immunol,1997;27(4):952

　　［6］Lang F,Peyrat M A,Constant P et al.Early activation of human Vγ9V δ2T cell broad cytotoxicity and TNF production by nonpeptidic Myobacterial ligands.J Immunol,1995;154(11):5986

　　［7］Sireci G,Champagne E,Fournie J J et al. Patterns of phosphoantigen stimulation of human Vγ9/Vδ2 T cell clones include Th0 cytokines.Human Immunol,1997;88(2):70

　　［8］Takamizawa M,Fangnoni F, Mehta-Daamani A et al.Cellular and molecular basis of human γδT cell activation.J Clin Invest,1995;95(1):296

收稿日期：1999-04-28

修回日期：1999-07-19