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百日咳毒素S1亚单位缺失分子的构建及其在重组杆状病毒中的表达①
中国免疫学杂志 2000年第1期第16卷 分子与细胞免疫学
作者：李庆雷 于康震 马丽英 王孝铭
单位：李庆雷(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室 哈尔滨 150001)；于康震(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室 哈尔滨 150001)；马丽英(哈尔滨医科大学病理生理教研室 哈尔滨 150086)；王孝铭(哈尔滨医科大学病理生理教研室 哈尔滨 150086)
关键词：百日咳毒素；S1亚单位；重组杆状病毒；信号肽；疏水区
摘 要：目的：为探明羧基端疏水区对百日咳毒素S1亚单位分泌性的影响，试图构建缺失羧基端疏水区的S1亚单位。方法：应用PCR技术构建了6种不同信号序列修饰的缺失羧基端疏水区的S1亚单位编码基因，并使用重组杆状病毒(rBV)技术实现了这些缺失S1亚单位(tS1)在昆虫细胞中的高水平表达。结果：这些缺失S1亚单位的表达量为每万个昆虫细胞1.01～2.25 μg。细菌信号肽和流感病毒HA信号肽均能完整表达和正确剪切，但HA信号肽在昆虫细胞中的处理效率更高。结论：tS1亚单位缺失羧基端疏水区后在昆虫细胞中的表达量明显提高，这些tS1亚单位的异源性表达是由于信号肽剪切不全所导致，tS1分子表观分子量的漂移并不意味着信号肽剪切不正确。
分类号：R378.42
Expression of truncated S1 subunit of pertussis toxin in recombinant baculoviruses
LI Qing-Lei
Harbin Veterinary Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150001
YU Kang-Zhen
Harbin Veterinary Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150001
MA Li-Ying
Department of Pathophysiology of Harbin Medical University,Harbin 150086
WANG Xiao-Ming
Department of Pathophysiology of Harbin Medical University,Harbin 150086
Abstract：Objective：In order to investigate the effect of the hydrophobic domains on secretion of the subunits,we deleted the hydrophobic domains from the S1 subunits.Methods:Six signal modified S1 encoding DNA fragmants were constructed that lacked C-terminal hydrophobic sequences using PCR technique expecting to get secreted S1 proteins.Results:Those truncated S1(tS1)subunits were abundantly expressed by recombinant baculoviruses in insect cells (expression levels ranged from 1.01 to 2.25 μg/104 cells).The HA signal could be processed more efficiently than the native one,although they both could be cleaved correctly.Conclusion:The expression levels of the tS1 subunits are increased significantly after the deletion of the hydrophobic domains.The heterologous expression of the tS1 proteins is the result of incomplete signal cleavage,and the apparent MW shifting does not imply incorrect signal cleavage.
Key words：Pertussis toxin S1 subunit Recombinant baculoviruse Signal sequence Hydrophobic domain▲
百日咳是一种严重的呼吸系统疾病，在婴儿中具有很高的发病率及死亡率，其病原菌(百日咳杆菌)能产生包括百日咳毒素(PT)在内的十多种毒性因子，其中PT既是主要毒性因子，又是预防百日咳的主要保护性抗原。PT是一个具有A-B结构的六聚体蛋白，A结构即S1亚单位，PT的毒性(ADP-核糖转移酶活性)和主要保护性抗原决定簇就位于该亚单位上［1］。传统的百日咳疫苗是用化学方法灭活的全细胞疫苗，它具有较广泛的毒副作用。Burnette等应用定点诱变术构建了一种S1变异子(R9→K)，其酶活性丧失，却仍保持主要保护性决定簇［2］。于康震等在此基础上对天然及变异S1亚单位编码基因进行了一系列分子修饰，并使用重组杆状病毒(rBV)技术高水平表达了这些亚单位［3］。但研究发现，S1亚单位既使经流感病毒HA信号序列修饰(S1/3-4)，仍不能由昆虫细胞分泌［4］。应用计算机辅助分析发现在S1/3-4亚单位羧基端有2个主要疏水区，分别包括19(201～219)和14(239～252)个疏水性氨基酸。其长度与强度足以发挥嵌膜作用。为探
明羧基端疏水区对其分泌性的影响，本研究中我们构建了6种不同信号序列修饰、缺失羧基端疏水区的S1亚单位编码基因，并应用rBV系统成功地高水平表达了这些缺失分子，为其分泌性及免疫学特性的进一步鉴定打下了基础。
1 材料与方法
1.1 细胞系、病毒及质粒 昆虫细胞系Sf9及High5由美国加利福尼亚大学兽医学院国际热带病原分子生物学实验室提供。培养基为完全Grace's培养基添加10%胎牛血清、100 U/ml青链霉素、2.5 μg/ml二性霉素B，27℃传代培养。核多角体病毒(AcNPV)DNA和杆状病毒转移载体质粒pVL1392购自Invitrogen公司。
1.2 主要试剂 限制性内切酶、聚合酶、连接酶等购自Boehringer Mannheim公司；PT购自Sigma公司；抗S1亚单位的单克隆抗体1B7［5］由Sato博士惠赠，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG购自中国军事医学科学院。
1.3 缺失羧基端疏水区S1亚单位编码基因的构建 分别以6种全长S1亚单位编码基因［含细菌信号序列的天然(S1/1)及变异(S1/1-4)、不含信号序列的天然(S1/2)及变异(S1/2-4)、携带流感病毒信号序列的天然(S1/3)及变异(S1/3-4)S1亚单位编码基因］［3］为模板，应用聚合酶链反应(PCR)技术，扩增了相应的不含羧基端疏水区的S1亚单位编码基因(分别命名为tS1/1,tS1/1-4,tS1/2,tS1/2-4,tS1/3,tS1/3-4)。所用PCR引物为：P1 5’＞CCG GAT TAT TCA TAC CGT CCC ACC＜3’，P2 5’＞TTA GAT CGA CGC TAC GGA CCT TCG CGA＜3’。
1.4 重组转移载体的构建 将6种PCR产物和转移载体pVL1392分别用相应的限制性内切酶消化后连接，转化大肠杆菌DH5α。用原位杂交及酶切分析筛选和鉴定重组质粒(pVLS1)。
1.5 重组杆状病毒的构建 采用线性转染技术(Invitrogen)［3］。以线性AcNPV DNA与pVLS1共转染昆虫细胞Sf9，经蚀斑筛选、纯化技术获得重组病毒。
1.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及免疫印迹(Western blot)分析 以6种rBV感染High5细胞单层(感染量MOI=10)，在感染后72 h收集细胞，直接溶于加样缓冲液中，分离胶浓度为15%，浓缩胶浓度为5%。以PT和AcNPV感染的细胞作对照。SDS-PAGE凝胶用考马斯亮蓝R-250染色。免疫印迹参照文献［6］进行。以抗S1亚单位的单克隆抗体1B7及辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG用于免疫学检测。
1.7 tS1亚单位表达水平及信号肽处理 按以前报道的方法测定每万个昆虫细胞中tS1亚单位的表达量和分析tS1亚单位信号肽在昆虫细胞中的处理效率［3］。
2 结果
2.1 S1亚单位缺失分子编码基因及重组病毒构建 用PCR技术扩增出了6种缺失羧基端疏水区的S1亚单位编码基因，然后将其分别插入pVL1392中，以pVLS1重组质粒与AcNPV DNA共转染Sf9细胞，获得表达6种tS1分子的rBV。
2.2 tS1亚单位在昆虫细胞中的表达 以SDS-PAGE(图1)及Western blot分析检测了6种tS1亚单位的表达情况。6种tS1亚单位均能在昆虫细胞中高水平表达，其表达水平大多数在细胞总蛋白的20%以上。免疫印迹显示，tS1呈明显的异源性表达：缺少信号肽的为单一条带，其表观分子量(MW)与预测MW一致；含有信号肽的为双带，其表观MW与预测MW间有细微的差别(表1)。
表1 tS1亚单位在昆虫细胞中的表达
Tab.1 Expression of tS1 subunits in insect cells
| tS1 | Band | Predicted MW(kD) | Apparent MW(kD) | Percentage1)(%) | Expression level(μg/104 cells) |
| 1 | Upper | 24.0 | 23 | 17.3 | 1.01 |
| Lower | 20.3 | 19 | |||
| 1-4 | Upper | 24.0 | 23 | 26.3 | 1.97 |
| Lower | 20.3 | 19 | |||
| 2 | Single | 20.3 | 20 | 21.5 | 1.23 |
| 2-4 | Single | 20.3 | 20 | 25.0 | 1.90 |
| 3 | Upper | 22.1 | 21 | 30.0 | 2.13 |
| Lower | 20.3 | 19 | |||
| 3-4 | Upper | 22.1 | 21 | 34.0 | 2.25 |
| Lower | 20.3 | 19 |
Note:1)Percentage of each tS1 protein in total stainable proteins
图1 tS1亚单位的SDS-PAGE分析
Fig.1 Analysis of tS1 subunits by SDS-PAGE
Note:M:Molecular weight standards;PT:Pertussis toxin;W:Cells infected with AcNPV;Lane 1 to 6:Cells infected with 6 rBVs expressing tS1/1,tS1/1-4,tS1/2,tS1/2-4,tS1/3,tS1/3-4 respectively
2.3 tS1亚单位信号肽的处理 对S1亚单位氨基端的微量序列分析(10个循环)显示，上带含有完整信号肽，而下带不含有信号肽。这表明细胞及流感病毒信号肽在昆虫细胞中均能完整表达和正确剪切，但切割不完全(表2)。
表2 tS1亚单位信号肽在昆虫细胞中的处理
Tab.2 Signal processing of tS1 subunits in insect cells
| tS1 | Band | N-terminal1) | Signal cleavage(%) |
| 1 | Upper | Native signal | |
| Lower | Native S1 | 16 | |
| 1-4 | Upper | Native signal | |
| Lower | Mutant S1 | 11 | |
| 2 | Single | Native S1 | |
| 2-4 | Single | Mutant S1 | |
| 3 | Upper | HA signal | |
| Lower | Native S1 | 37 | |
| 3-4 | Upper | HA signal | |
| Lower | Mutant S1 | 40 |
Note:1) N-terminus of each tS1 band was analyzed by a microsequenator for 10 cycles.Native signal： M-R-C-T-R-A-I-R-Q-T;Native S1:D-D-P-P-A-T-V-Y-R-T;Mutant S1:D-D-P-P-A-T-V-Y-K-Y;HA signal:M-K-A-K-L-L-V-L-L-Y
3 讨论
在先前的研究中，于康震等对分子修饰的天然及变异(R9→K)S1亚单位的生物学等特性作了初步鉴定［3］。为探明羧基端疏水区对其分泌性的影响，进一步评价重组S1亚单位的免疫原性及免疫保护性，全面评价重组S1亚单位作为疫苗成分的潜在可能，我们应用rBV系统在昆虫细胞中高水平表达了6种不同信号序列修饰的缺失羧基端疏水区的S1亚单位。以往的研究表明全长S1亚单位的表达特点为含有天然细菌信号肽者(S1/1和S1/1-4)表达量最高，而无信号肽者(S1/2和S1/2-4)表达量最低［4］。无信号肽的S1亚单位在大肠杆菌中表达时，表达水平亦很低，需要用免疫印迹分析才能检出［7］。而本研究中不含信号肽的缺失羧基端疏水区的tS1在昆虫细胞中的表达量则明显提高(可占细胞总蛋白的20%以上)。每种tS1亚单位的表达量均高于每万个昆虫细胞1.0 μg。
应用抗S1的单克隆抗体的免疫印迹分析显示，不含信号肽的tS1(tS1/2,tS1/2-4)亚单位为单一条带，表观MW与预测MW一致。含有信号肽的tS1(tS1/1、tS1/1-4、tS1/3和tS1/3-4)亚单位则呈双带，每条带的表观MW与预测MW之间略有偏移，这与已有的报道一致［3，6］。研究表明rS1亚单位在昆虫细胞中表达时无N端糖基化，其信号肽剪切是正确的，但不完全［8］。因此我们认为，tS1亚单位异源性表达的特征是由于信号肽剪切不全所致。表观MW与理论MW间的偏差并不表示N端糖基化或信号肽切割错误，而是意味着信号肽可能会影响其等电点或构象(虽然信号肽会被剪切)，最终导致SDS-PAGE中迁移率的变化。
我们将开展进一步的研究以评价tS1亚单位的分泌性及免疫学特性。■
①国家自然科学基金资助项目(编号 39580022)
②哈尔滨医科大学病生教研室，哈尔滨 150001
③通讯作者
作者简介：李庆雷，男，27岁，在读博士研究生；
于康震，男，39岁，研究员，博士生导师
参考文献：
［1］Moss J,Vaughan M. ADP-ribosylation of guanine nucleotide-binding regulatory proteins by bacterial toxins.Adv Enzymol,1988;61:303
［2］Bunette W N,Cieplak W,Mar V L et al.Pertussis toxin S1 mutant with reduced enzyme activity and a conserved protective epitope.Science,1988;242:72
［3］于康震，Burnette W N,Kaslow H R et al.百日咳毒素S1亚单位的分子修饰及在重组杆状病毒中的表达.中国免疫学杂志，1999；15(1)：52
［4］于康震，Barnetlc W N,Kaslow H R et al. 分子修饰的重组百日咳毒素S1亚单位的生物学和免疫学特性.中国免疫学杂志，1999；15(3)：151
［5］Sato H,Ito A,Chiba J et al.Monoclonal antibody against pertussis toxin:effect on toxin activity and pertussis in fections.Infect Immun,1984;46:422
［6］Matsuura Y,Sato H,Sato Y.Expression of the S1 subunit of pertussis toxin using a recombinant baculoviruse.Develop Biol Stand,1991; 73:79.
［7］Burnette W N,Mar V L,Cieplak W et al.Direct expression of Bordettela pertussis toxin subunits to high levels in Escherichia Coli.Bio/Technol，1988;6:699
［8］Storsaeter J,Olin P,Renemar B et al.Mortality and morbidity from invasive bacterial infectons during a clinical trial of acellular pertussis vaccines in Sweeden.Pediatr Infect Dis,1988:7:637
收稿日期：1998-04-26
修回日期：1998-09-07