点击显示 收起
抗人M和N型GPA特异性单克隆抗体的制备和鉴定①
中国免疫学杂志 2000年第2期第16卷 免疫学技术与方法
作者：董燕 毛建平 刘斌 孙志贤
单位：董 燕（军事医学科学院放射医学研究所 北京 100850）；毛建平（军事医学科学院放射医学研究所 北京 100850）；刘 斌（军事医学科学院放射医学研究所 北京 100850）；孙志贤（军事医学科学院放射医学研究所 北京 100850）
关键词：MN血型；血型糖蛋白A；单克隆抗体
摘 要：目的：为了建立“血型糖蛋白A（Glycophorin A, GPA）突变分析”技术。方法：采用杂交瘤技术制备单克隆抗体（McAb）。结果：获得3株分泌抗GPA特异性McAb的杂交瘤细胞系，这3株McAb均属于IgG2a亚类、Kappa型轻链，其中2株特异性抗M型GPA，另外1株特异性抗N型GPA。3株McAb所针对的抗原决定簇位于GPA多肽链N末端第1～39位氨基酸之内，抗体与其结合依赖糖链的完整性。结论：制备的McAb可用于“GPA突变分析”的研究，也可以作为血型试剂在血液免疫学、遗传学和法医学的领域中应用。
分类号：R392.11
Preparation and characterization of monoclonal antibodies to M- and N-forms of human glycophorin A
DONG Yan
（Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850）
MAO Jian-Ping
（Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850）
LIU Bin
（Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850）
Abstract：Objective: To develop the “glycophorin A (GPA)somatic cell mutation assay”. Methods: Monoclonal antibodies (McAb) were prepared by hybridoma technique .Results: Three mouse monoclonal antibodies against human glycophorin A have been produced . They all belong to IgG2a subclass, Kappa type light chain. Two of them are specific for M form and one for N form GPA. They bind to determinants presented on the 1～39 amino acid N-terminal peptide of GPA, their binding depend on intact oligosaccharides.Conclusion: These antibodies is applicable for “GPA somatic cell mutation assay”, also useful in blood immunology, genetics and medical jurisprudence.
Key words：MN blood group Glycophorin A Monoclonal antibody▲
GPA是人红细胞膜表面主要糖蛋白，存在M和N 2种结构形式，是决定MN血型系统的抗原。近年发现，GPA在体细胞突变研究中是个有价值的分子标志，源于“GPA突变分析”技术的建立和应用［1］。该技术以不同荧光标记的抗GPA特异性单抗为主要检测试剂，结合流式细胞仪分析，检测人外周血中红细胞的变异频率［2，3］，并在生物剂量计和癌患风险评估方面得以应用，获得了较有意义的结果。我们制备了抗M和N型GPA的特异性McAb,以期“GPA突变分析”技术的建立和应用。
1 材料与方法
1.1 抗原 新鲜采取健康人O型红细胞，用血型试剂（长春博德生物技术有限公司）鉴定和筛选出OM和ON型红细胞。
1.2 动物免疫 经PBS洗涤和悬浮的OM和ON型红细胞，注射6～8周龄Balb/c小鼠腹腔，108细胞/只，第2周重复注射1次，第3周尾静脉注射2×106细胞/只，3 d后取脾细胞进行细胞融合。
1.3 杂交瘤细胞系的建立 2×107SP2/0小鼠骨髓瘤细胞与108免疫小鼠脾细胞在PEG-1500（Serva公司）作用下进行融合。生长的杂交瘤培养上清用细胞凝集法筛选：在96孔平底聚苯乙烯软板复孔中加入杂交瘤培养上清，1滴/孔，随后加入PBS（pH7.4）洗涤和配制的20％OM和ON型红细胞悬液，5 μl/孔，室温振荡30 min，肉眼观察凝集反应结果。选择仅对OM或ON型红细胞发生凝集的培养上清孔的杂交瘤细胞进行克隆和亚克隆，经扩大培养后，注射Balb/c小鼠腹腔诱生腹水。
1.4 McAb效价测定 细胞凝集法测定杂交瘤培养上清和腹水的抗体效价。
1.5 McAb类型测定 使用Isostrip kit(Boehriger公司)，按试剂盒说明书操作。
1.6 McAb特异性测定
1.6.1 间接免疫荧光试验 在细胞凝集试验步骤之后，用PBS洗涤细胞2次，再加入稀释100倍的羊抗鼠IgG-FITC(Jackson公司)，50 μl/孔，室温反应45 min，同前洗涤细胞，荧光显微镜（Olympus）下观察红细胞膜荧光。
1.6.2 免疫印迹试验 分别以M型和N型红细胞制备膜蛋白［4］，进行SDS-PAGE（12％），一份凝胶用过碘酸-希夫试剂（PAS）染糖蛋白，另一份凝胶对硝酸纤维素膜电转移（50 V过夜），然后对膜进行免疫反应，底物DAB显色。
1.7 McAb结合抗原的表位测定 用经胰蛋白酶(Sigma)和神经氨酸酶(Sigma)作用后的红细胞与McAb进行细胞凝集和间接免疫荧光实验。酶作用条件：洗涤后的M型或N型压积红细胞50 μl，悬浮于0.5 ml 20 mmol/L Tris-HCl缓冲液（含5 mmol/L CaCl2，pH8.0）,加入1 mg胰蛋白酶；或同样的红细胞悬浮于20 mmol/L醋酸盐缓冲液（pH5.0）,加入0.5 U神经氨酸酶，37℃温育4 h，PBS离心洗涤和悬浮细胞，用于细胞凝集和间接免疫荧光试验。
1.8 McAb对血型的检测 用自制McAb与长春博德生物技术公司的血型试剂平行随机检测血样本的MN血型系统。
2 结果
2.1 杂交瘤细胞系的建立 细胞融合后，经过对阳性克隆的筛选和连续克隆化，建立了5株分泌特异性 McAb的杂交瘤细胞系，其中4株与M型红细胞、1株与N型红细胞发生特异性凝集反应。5株杂交瘤细胞均在小鼠体内诱生了腹水。我们对其中2株(3G4、5E11)凝集M型红细胞和1株(5C7)凝集N型红细胞的McAb进行了进一步的鉴定。
2.2 McAb的效价 细胞凝集法测得杂交瘤细胞培养上清和腹水的抗体效价（表1）。
表1 McAb的凝集效价
Tab.1 Hemagglutination titers by McAb
| McAb | RBC type | Culture medium | Ascites |
| 3G4 | M | 1∶64 | 1∶10 000 |
| 5E11 | M | 1∶32 | 1∶5 000 |
| 5C7 | N | 1∶16 | 1∶2 000 |
2.3 McAb的类型 Isostrip kit测得3株McAb均属于IgG2a亚类、Kappa型轻链。
2.4 McAb的特异性
2.4.1 McAb与红细胞膜抗原结合的特异性 间接免疫荧光试验显示，3G4和5E11仅与M型、5C7仅与N型红细胞膜抗原呈现免疫荧光阳性反应。
2.4.2 McAb对GPA分子识别和结合的特异性 免疫印迹试验的结果显示，3G4和5E11能识别和结合M型红细胞膜蛋白中的GPA蛋白带，与N型红细胞膜蛋白没有交叉反应；而5C7能识别和结合N型红细胞膜蛋白中的GPA蛋白带，与M型红细胞膜蛋白没有交叉反应（图1）。
图1 McAb的免疫印迹
Fig.1 Western-blotting of McAb
Note:A.H:red cell membrane proteins stained with PAS;B.C:western-blotting of 3G4;D.E:western-blotting of 5E11;F.G:western-blotting of 5C7;H: monoclonal antibody
2.5 McAb结合抗原的表位 3株McAb与经胰蛋白酶或神经氨酸酶作用后的M型和N型红细胞的凝集和间接免疫荧光反应均为阴性结果。
2.6 McAb对血型的检测 自制McAb与长春博德生物技术公司的血型试剂平行随机检测200多例血液标本的MN血型系统，所得血型结果完全一致。
3 讨论
GPA分子是由131个氨基酸残基和16条寡糖链组成的糖蛋白，含有人类MN血型系统的抗原决定簇，因其多肽链N末端1,5位氨基酸的多态性而决定人群不同的MN血型系统（M、N和MN型）。当N末端1,5位分别为丝氨酸和甘氨酸时决定M血型；而其相应位置为亮氨酸和谷氨酸时，决定N血型。除此之外，分子中其它氨基酸的序列均相同［5］。正由于M和N型GPA氨基酸序列的高度同源性，导致特异性McAb的制备十分困难。经我们对多次细胞融合和大量筛选工作的统计，对M和N型GPA发生交叉反应抗体的阳性率可达20％以上，而特异性抗M型或抗N型GPA抗体的阳性率仅为0.1%左右。这种特异性抗体产生的极低频率正是由于抗原结构的微小差别所致。我们制备的3株McAb，经多方面鉴定，证明其中3G4和5E11为抗M型GPA，5C7为抗N型GPA，相互之间不存在交叉反应，具有良好的特异性。已有的研究证明，GPA肽链N末端第39位氨基酸是胰蛋白酶作用的敏感位点，而神经氨酸酶则可以水解糖链中的N-乙酰神经氨酸。抗原表位测定结果显示，两酶分别作用红细胞后，均抑制3株McAb对相应红细胞膜抗原的结合，表明这些McAb所针对的抗原决定簇位于GPA肽链N末端39位氨基酸以内，且神经氨酸是抗原决定簇不可缺少的组成成分。抗体与抗原的结合不仅与肽链的氨基酸序列有关，而且依赖完整糖链的存在。由此推测抗原决定簇是由糖和肽共同组成，这点与国内外的有关报道相一致［6，7］。
为了给“GPA突变分析”技术的建立提供必要条件，我们制备了特异性抗M型和N型GPA的McAb。目前，已完成抗体的纯化和标记，并结合流式细胞仪分析，观察其在“GPA突变分析”技术中应用的可行性。除此之外，这些McAb也是良好的血型试剂，在血液免疫学、遗传学和法医学的研究领域中都有实际应用价值。■
①全军九五指令性课题(9605002)基金资助
作者简介：董 燕，女，45岁，高级实验师；
孙志贤，男，58岁，研究员，博士生导师，全军生物化学专业委员会主任委员，从事生物化学与分子生物学研究
参考文献：
［1］王继先．放射生物剂量学．北京：原子能出版社，1997：109-122
［2］Langlois R G, Nisbet B A, Bigbee W L et al.An improved flow cytometric assay for somatic mutations at the glycophorin A locus in humans.Cytometry,1990;11: 513
［3］Jensen R H, Bigbee W L. Direct immunofluorescence labeling provides an improved method for the glycophorin A somatic cell mutation assay.Cytometry,1996;23:337
［4］张龙翔，张庭芳，李令媛．生化实验方法和技术．北京：高等教育出版社，1981：21-23
［5］毛建平，孙志贤．人红细胞膜血型糖蛋白的研究进展．生物化学与生物物理进展，1994；21(1)：6
［6］Bigbee W L,Vanderlaan M,Fong S S N et al. Monoclonal antibodies specific for the M- and N-forms of human glycophorin A.Molecular Immunology，1983;20(12)： 1353
［7］张 建，鲍 蕾，段 薇 et al．抗M血型抗原单克隆抗体特性的研究．中国生物制品学杂志，1996；9(2)：58
收稿日期：1999-01-27
修回日期：1999-03-29