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检测HBVDNA/Ig-双特异性循环免疫复合物的免疫捕捉法PCR①
中国免疫学杂志 2000年第2期第16卷 免疫学技术与方法
作者：周裕林 彭宣宪 柳珑 肖军生 岑岭 杨天赐
单位：周裕林(厦门大学生物系厦门大学细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室 厦门 361005)；彭宣宪(厦门大学生物系厦门大学细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室 厦门 361005)； 柳 珑(厦门大学生物系厦门大学细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室 厦门 361005)； 肖军生(厦门大学生物系厦门大学细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室 厦门 361005)
关键词：免疫捕捉法PCR；循环免疫复合物；HBVDNA
摘 要：目的：建立一种免疫捕捉法PCR技术，研究血清免疫复合物中不同Ig类型抗体结合HBV的情况，并初步探讨其意义。方法：以羊抗人μ、γ、α链的IgG为捕捉抗体， 再利用PCR扩增捕捉物中的HBVDNA。结果：成功地建立了检测 HBV-DNA/IgM、IgG和IgA-TCIC的免疫捕捉法PCR技术。该技术特异性强、敏感性高、重复性好，可以显著提高HBVDNA的检出率。同时发现，结合HBV的抗体的Ig类型组合有明显差异，三者均阳性最高。结论：说明乙肝患者血清免疫复合物中有较多的病毒颗粒。研究HBVDNA/Ig-TCIC对乙肝发病机理的深入阐明可能具有重要意义。
分类号：R392-33
Immuno-capture PCR for HBVDNA/Ig-two-component-determined circulating immune complexes
ZHOU Yu-Lin
（Department of Biology,the Education Minister Key Laboratory for Cell Biology and Tumor Cell Engineering, Xiamen 361005）
PENG Xuan-Xian
（Department of Biology,the Education Minister Key Laboratory for Cell Biology and Tumor Cell Engineering, Xiamen 361005）
LIU Long
（Department of Biology,the Education Minister Key Laboratory for Cell Biology and Tumor Cell Engineering, Xiamen 361005）
Abstract：Objective: To establish an immuno-capture PCR for the study of classes of immunoglobulins complexed with HBV and of their significance.Methods:Using goat-IgG to human μ、γ、α chain as capture antibodies and prime-specific PCR as a detecting method.Results:An immuno-capture PCR had been established to detect HBVDNA/Ig-TCIC (HBVDNA/IgM-TCTC,HBVDNA/IgG-TCIC, HBVDNA/IgA-TCIC). This method was specific,sensitive and reproducible,by which more patients with positive HBVDNA could be found. It was also characted that there were significantly different positive rates among the types of combinations of IgM,IgG and IgA, in which the group with the three of them was hightest.Conclusion:These findings suggested that more HBV may be hide within circulating immune complexes and the study of HBV-DNA/Ig-TCIC may play an important role in more understanding of pathogenesis in patients with hepatitis B.
Key words：Immuno-capture PCR Circulating immune complex HBVDNA▲
按双特异性免疫复合物(TCIC)的新概念，病原体/Ig-TCIC与抗原/Ig-TCIC不同，前者含有核酸，后者可能不含遗传物质［1］ 。病原体是传染病的始动因子，故研究不同Ig类型抗体结合病原体的情况具有重要意义， 但目前少见报道。本文将免疫捕捉法和PCR技术有机地结合起来，以HBV为研究对象，成功地建立了检测 HBVDNA/Ig-TCIC ( HBVDNA/IgM、IgG和IgA-TCIC)的免疫捕捉法PCR技术，并对其意义进行了初步探讨。
1 材料与方法
1.1 研究对象 乙肝血清标本共108例，采自厦门市中医院，临床诊断按北京会议修订标准进行。另取健康献血员血清标本15例和丙型肝炎血清标本5例分别作阴性和疾病对照。
1.2 实验材料 抗人IgM、IgG和IgA(依次为μ、γ、α链特异性)的羊IgG：卫生部上海生物制品研究所产品。HBV基因引物：根据HBVadr亚型pADR-1株基因，Sangon公司合成，经鉴定为电泳纯，正股1861～1878 5'-TGTTCAAGCCTCCAAGCT-3'；负股2268～2284 3'-AGTGCGAATCCACACTC-5'。PCR试剂盒(热变性法)：厦门泰伦生物公司产品。 限制性内切酶:Sau3A I promege产品。
1.3 HBVDNA/IgM、IgG和IgA-TCIC的检测
1.3.1 血清处理 参见文献［2］进行。简述如下：取血清用终浓度为3.5%的PEG沉淀2次，弃上清，沉淀用等血清体积的PBS溶解。
1.3.2 免疫捕捉 分别包被羊IgG抗人IgM、IgG和IgA (依次用于HBVDNA/IgM、IgG和IgA-TCIC的检测)7.5 μg/ml，每孔50 μl，4℃18 h，PBS-T洗涤3次；取上述沉淀溶解物40 μl加入反应孔，37℃1 h，同上洗涤6次；每管加入无菌双蒸水40 μl，于95℃变性20 min， 得变性液。
1.3.3 PCR扩增 10.buffer 5 μl、混合dNTP液(各10 mmol/L)1 μl、MgCl2 (25 mmol/L)4 μl、引物各15 pmol、1U Taq酶和变性液30 μl、补足水至50 μl反应体积。94℃变性1 min，55℃复性30 s，72℃延伸1 min，共循环35次，最后以72℃10 min结束循环。每批做阴阳性标本各3管。
1.4 热变性法检测全血清HBVDNA 参见文献［3］进行，扩增条件同上。
2 结果
2.1 特异性考察
2.1.1 阻断试验 随机取阳性血清5份，参照文献［4］进行。结果IgM和IgA组2例阳性和1例强阳性标本阻断后为阴性，另2例强阳性标本阻断后为弱阳性；IgG组阻断后只1例弱阳性，其余均为阴性。
2.1.2 中和试验 取上述阻断试验用标本，参照文献［4］进行。结果3组均为2例阳性和1例强阳性标本中和后为阴性，另2例强阳性标本中和后为弱阳性。
2.1.3 替代试验 对15例健康献血员和5例丙肝患者血清进行检测，结果所有健康献血员标本均为阴性，5例丙肝患者中有1例标本为HBVDNA/IgM和IgA-TCIC同时阳性。
2.1.4 重复性考察 每批试验均同时做3例阳性和3例阴性标本，共做15批。所有45份阴性标本均为阴性；在45份阳性标本中，“++”为38次(84.4%)，其余7次在上下波动。
2.1.5 酶切鉴定 随机取反应产物进行Sau3A I酶切，结果其片段与理论分析一致，见图1。
图1 PCR产物限制性酶切图谱
Fig.1 Restriction mapping and electrophorisis analysis of PCR production
Note:M.marker; 1.positive control; 2.Sau3A I cuts
表1 3类HBVDNA/Ig-TCIC 8种组合模式的检测结果
Tab. 1 Distribution of cases in eight models of HBVDNA/Ig-TCIC
| HBVDNA/
IgM-TCIC |
HBVDNA/
IgG-TCIC |
HBVDNA/
IgA-TCIC |
Cases |
| + | + | + | 36 |
| + | + | - | 9 |
| + | - | + | 11 |
| - | + | + | 8 |
| + | - | - | 14 |
| - | + | - | 6 |
| - | - | + | 10 |
| - | - | - | 14 |
Note:P＜0.01
2.2 3种方法检测血清HBVDNA的比较 随机取乙肝标本23例，同时用热变性PCR技术、PCR试剂盒和免疫捕捉法PCR技术检测，3种方法的阳性率依次为52.2%、56.5%和87.0%。χ2 检验表明，前两者间无明显差异，但均显著低于免疫捕捉法PCR的检出率。
2.3 乙肝3类HBVDNA/Ig-TCIC的检测结果 108例乙肝的HBVDNA/IgM、IgG和IgA-TCIC阳性率依次为70.4%、56.5%和64.8%，相互间无明显差异。按3者阴阳性不同可以组合成8种模式。χ2 检验表明，全部模式间存在非常显著差异，其中3类均阳性组非常显著高于其它7种模式。HBVDNA/IgM-TCIC单阳性显著高于HBVDNA/IgG-TCIC单阳性，见表1。
3 讨论
本文先以羊抗人μ、γ、α链特异性的羊IgG包被反应板，分别用以捕捉特异性抗Dane颗粒的IgM、IgG和IgA类抗体，再利用PCR的强大扩增能力和引物特异性对捕捉物中的HBVDNA进行检测，从而建立了检测3种HBVDNA/ Ig-TCIC的免疫捕捉法PCR技术。实验证明，该法特异性强、敏感性高、重复性好。采用该法对108例乙肝临床标本进行检测，结果其 HBVDNA/IgM、IgG和IgA-TCIC阳性率依次为70.4%、56.5%和64.8%，相互间无明显差异。值得注意的是，HBVDNA/Ig-TCIC的反应模式差异非常显著，以3者均阳性最为多见，而以HBVDNA/IgG-TCIC单独性和3者均阴性较少见。这些结果提示，Ig的异质性在结合病原体中亦得到体现［5］。
为考察该阳性率的意义， 我们随机取23份血清标本同时按本文建立的PCR和市售PCR试剂盒(引物基本相同)进行全血清热变性检测，结果相互间无明显差异， 且均非常显著低于免疫捕捉法PCR的阳性率。这一结果说明，本免疫捕捉法所得的高阳性率可能是与抗体复合的病毒颗粒较多和免疫捕捉法PCR敏感较高的共同结果。
与由Sano创建，Ruzicka完善的免疫PCR技术不同［6，7］，本法并不是用人工偶联DNA作为扩增对象，而是扩增自然与抗体相结合的病原体DNA。本技术操作简单，材料易得，设备要求不高，可以扩展至对其它病原体/Ig-TCIC的检测。
HBV引物序列可从各功能区选择， 其中前-C/C区和前-X/X区因易变异和阳性率较高而最受重视［8，9］ 。本文考虑到对突变产物分析等后续工作及阳性率便于与市售试验盒比较这些因素，特选用前-C/C区附近的序列，其扩增片段为424 bp。我们亦考虑同时采用前-X/X区的引物， 进一步研究其意义。■
① 国家自然科学基金资助课题(39660075)
通讯作者：彭宣宪
作者简介：周裕林，男，26岁，硕士，现在厦门市妇幼保健院；
彭宣宪，男，43岁，教授，博士生导师，主要从事免疫生物学研究
作者单位：岑 岭(厦门大学生物系厦门大学细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室 厦门 361005)； 杨天赐(厦门大学生物系厦门大学细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室 厦； 门 361005)
参考文献：
［1］彭宣宪. 双特异性免疫复合物的研究进展. 上海免疫学杂志， 1996；16(5) :315
［2］彭宣宪， 高 静， 黄雪芳 et al. 脐血免疫复合物的检测及其意义. 中国公共卫生学报， 1997; 16(4):187
［3］邵 力，巫协宁，徐 萍 et al.聚合酶链反应检测血清HBV-DNA方法的建立及实验条件分析. 中国免疫学杂志， 1993; 9(1):58
［4］彭宣宪， 方 亮. 乙型肝炎患者血清中IgA类HBsAg特异性免疫复合物的初步研究. 中华微生物学和免疫学杂志， 1988; 8(6):379
［5］彭宣宪，王三英，黄雪芳. 乙肝IgM和IgG-补体双特异性循环免疫复合物的意义. 病毒学报， 1997; 13(4):224
［6］Sano T， Smith C L， Cantor C R.Immuno-PCR:very sensitive antigen detection by means of specific antibody-DNA conjugates. Science， 1992;258(2):120
［7］Ruzicka V， Marz W， Russ A et al. Immuno-PCR with a commercially avaliable avidin system. Science， 1993; 260(6): 698
［8］姚 桢. 分子乙型病毒性肝炎相关病学. 北京:中国医药出版社，1998：8-38
［9］Hsia C C， Nakashima Y， Tabor E.Deletion mutants of the hepatitis B virus X gene in human hepatocellular carcinoma. Biochemical and Biophysical Research Communications， 1997; 241(7):726
收稿日期：1998-05-26
修回日期：1999-01-28