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BrdU抗原及抗体的制备
中国免疫学杂志 2000年第2期第16卷 免疫学技术与方法
作者:李新明 赵学平 李新华 周晓健 何荣根
单位:李新明(河南医科大学一附院 郑州 450052);赵学平(河南医科大学一附院 郑州 450052);李新华(新乡市第一人民医院 新乡 453000);周晓健(上海第二医科大学第九人民医院 上海 200011);何荣根(上海第二医科大学第九人民医院 上海 200011)
分类号:R392.33
溴脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine,BrdU)可替代DNA前体胸腺嘧啶核苷竞争掺入S期细胞DNA,取代 3H-TdR的应用,避免放射性污染,且检测方便省时。核苷属小分子半抗原,不能刺激机体产生抗体,需与大分子载体连接成完全抗原才引起宿主有效的免疫应答。本文将尿嘧啶核苷与卵清蛋白(ovalbumin,Ova)或牛血清白蛋白(burine serum albumin,BSA)共价结合,并证实偶联物具有免疫原性。
1 材料与方法
1.1 偶联抗原 用过碘酸氧化法偶合抗原[1],脱氧尿嘧啶核苷与过氧化物不能反应,因此用溴或碘尿嘧啶核苷(BrU或IU)分别与载体偶合成va-BrU,Ova-IU,BSA-BrU,BSA-IU。
1.2 偶联物测定 分别取偶联物1 ml经紫外分光光度计测定半抗原和载体的吸光密度值。小分子核苷和大分子蛋白吸光后所得的光谱不同,前者和后者分别在260 和280 nm处有最大光密度值(OD),据其比值可得半抗原浓度、载体浓度及载体与半抗原的克分子比[2]。核苷及蛋白的OD值各测定3次,取均值。
1.3 制备抗血清 用偶联Ova的抗原免疫4只1.7~2.0 kg雄性新西兰白兔,偶联抗原加等量完全福氏佐剂,首次免疫每毫升抗原佐剂加15 mg灭活卡介苗(BCG),以后每毫升加5 mg BCG,共免疫5次,分离的血清经琼脂免疫双扩散检测,再用偶联BSA载体的抗原经ELISA间接免疫法行载体抑制试验和抗血清效价测定。
2 结果
2.1 偶联物的吸光密度 各偶联物均为5 mg/ml左右浓度,吸收光谱的最大OD值分别为Ova-BrU260(2.754),280(2.926);Ova-IU260(2.624),2802.800),BSA-BrU260(0.435),280(0.635);BSA-IU260(2.711),280(2.981)。
2.2 偶联物含量及克分子比 见表1。
表1 偶联物含量及克分子比
Tab.1 Content and molar ratio of coupled conjugations
Coupler | Haptens
(mg/ml) |
Carriers
(mg/ml) |
Molar ratio
(carriers:haptens) |
Ova-BrU | 0.140 | 4.863 | 1:4.009 |
Ova-IU | 0.138 | 4.803 | 1:4.013 |
BSA-BrU | 0.141 | 4.870 | 1:4.011 |
BSA-IU | 0.150 | 4.780 | 1:5.936 |
2.3 抗血清效价 免疫终止后,抗体最高效价达1:6.4×105。3 讨论
本文成功地取得了1个载体连接4~6个半抗原的结果。通常认为连接5~15个半抗原分子为宜,也有认为每个载体仅接1个半抗原即足以产生抗体,载体所接的半抗原并非越多越好,覆盖的半抗原过多时影响载体与淋巴细胞或巨噬细胞表面受体结合,同样也影响有关的酶与载体接近,不利于抗体产生。本文通过30余次方阵滴定筛选ELISA包被等测定条件及载体抑制试验,证实所得抗血清为核苷半抗原所激发,完全可排除蛋白载体的影响。我们在后续研究中用此抗原及抗体掺入标记裸鼠肺转移癌模型,达到预期结果。■
作者简介:李新明,男,42岁,口腔颌面外科副主任医师,医学博士;
何荣根,男,64岁,口腔颌面外科主任医师,教授,博士生导师,主要从事肿瘤细胞生物学研究
参考文献:
[1]尹伯元编著. 放射免疫学测定基础.天津:天津科技出版社,1985:215
[2]夏宗勤主编. 实验核医学. 上海:同济大学出版社,1989:201
收稿日期:1999-01-26
修回日期:1999-05-01