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白介素8放射免疫分析的建立及初步应用
中国免疫学杂志 2000年第4期第16卷 免疫学技术与方法
作者：颜光涛 郝秀华 王录焕
单位：颜光涛（解放军总医院基础医学研究所生化研究室， 北京 100853）；郝秀华（解放军总医院基础医学研究所生化研究室， 北京 100853）；王录焕（解放军总医院基础医学研究所生化研究室， 北京 100853）
关键词：白介素8；放射免疫分析；休克；损伤
摘 要 目的：建立高灵敏和高特异性的IL-8放射免疫分析方法。方法：用人工重组的白细胞介素8(IL-8)多次免疫兔和豚鼠，获取高效价 的IL-8抗体。用氯氨T法制备125I标记IL-8，经Sephadex G-25 纯化，抗原抗体反 应采用平衡一步法，4℃培养24 h后经PR试剂分离结合和游离的标记抗原。结果 ：该法测定范围0.2～9.6 ng/ml，最低检出量为0.1 ng/ml，批内和批间误差分别 小于5%和10%。正常人血清含量为(0.35±0.01) ng/ml(n=64)。人粒细胞系HL-60细胞 体外培养24 h，钙离子载体A23187和内毒素脂多糖(LPS)可显著提高细胞释放IL-8，而蛋白激酶 C激活剂(PMA)却没有明显的促IL-8释放作用。另外，兔失血性休克再灌注损伤后24 h内不 同时间血清中IL-8水平明显高于对照。结论：该方法是一种简便、灵 敏和特异的IL-8分析方法，可用于人和兔血清以及细胞培养上清液中IL-8分析。
中国图书分类号 R392
The establish and primary application of interleukin 8 radioimmunoassay
YAN Guang-Tao HAO Xiu-Hua WANG Lu-Huan
（Research Laboratory of Biochem istry,Basic Medical Institute,General Hospital of PLA,Beijing 100853）
Abstract Objective：To found a high sensitive and high sp ecific radioimmunoassay method for interleukin 8.Methods:The high effect antibody was obtained by immunizing rabbits and guinea pigs wi th recombinant IL-8 many times. The IL-8 was iodinated with chloramine-T meth ods and purified by the SephadexG-25 chromatograph column. The reaction betwe en antigen with antibody was carried out by one step balance method and cultured i n 4℃ for 24 h,then separated binding and free antigen by PR reagent.Results:The determine range of this method was about 0.2～9.6 ng/m l,lowest detesting level was 0.1 ng/ml,error in group and between group were les s than 5% and 10% respectively. The level of IL-8 in normal peoples was(0.35± 0 .01) ng/ml(n=64). The liberation of IL-8 from HL-60 celline was obviously promot ed by cultured with calcium ionophore(A23187) and LPS for 24 h in vitr o but protein kinase C agonist(PMA) without the same effect as A23187 and LPS. Otherwise, the level of IL-8 in serum of rabbits was significantly higher than that of self-control at different time point within 24 h after hemorrhagic shock and reperfusion.Conclusion:This method was simp le,high sensitive and specific for detecting interleukin 8 in human and rabbit s erum as well as supernatant of cell culture.
Key words Interleukin 8 Radioimmunoassay Shock Injury
白介素8(IL-8)是一种对中性粒细胞功能有重要调节作用的小分子量多肽 ，产生于有丝分裂原刺激的T淋巴细胞、单核细胞、成纤维细胞、内皮细胞和表皮细胞 ［1］。某些间皮细胞和角化细胞受IL-1和TNF等因子刺激也能分泌IL-8。IL-8有4种不同 的N末端变型，分别由77、72、70和69个氨基酸组成，在溶液中为二聚体［2］。 它主 要通过2个受体发挥作用，在刺激趋化作用、调节补体受体表达和粘附分子的表达、促进血 管生成中有重要作用［2］。同时，作为对LPS应答初始反应的主要细胞因子，IL-8 在感染和炎症中起重要的作用［3,4］。鉴于IL-8在血清中浓度非常微量，通常的分 析方法难有足够的灵敏度。我们建立的放射免疫分析技术，可灵敏地检出人和兔血清中IL-8 的正常值和异常情况下的变化，还能用于细胞培养上清中IL-8的分析，现介绍如 下。
1 材料与方法
1.1 材料 免疫用新西兰兔3只(1.4 kg)，免疫用豚鼠3只(0.5 kg)，实验 用大耳白兔52只(2.5 kg)均为中科院动物所提供。人重组IL-8(北医大分子免疫室提供)， 福氏完全佐剂和不完全佐剂(GIBCORL)，A23187、PMA、LPS和标准IL-8(Sigma)，HL -60细胞(本室保存)，125I标记物(原子能研究院)，其它试剂均为国产分析纯。
1.2 抗血清制备［4，5］ 将纯化的IL-8 80 μg同3 ml福氏完全 佐 剂充分混匀后免疫3只新西兰兔，另取30 μg IL-8和2.1 ml福氏完全佐剂充分混匀后免疫3 只豚鼠。每月1次，末次为加强免疫后第7天，放血分离血清保存于-20℃。兔和豚鼠分别免 疫 5次和4次，所获血清同125I标记抗原的结合率为50%时的最终稀释度为1∶1.5×104 和1∶21.0×104。
1.3 抗原的标记［1，6］ 将2 μg IL-8溶于0.2 mol/L pH7.5 磷 酸缓冲液30 μl，加入碘化钠0.5 mCi，立即加入氯胺T 10 μg(10 μl)，混匀反应30 s后 加入偏重亚硫酸钠 20 μg (20 μl)终止反应；将所有反应体积加至相同缓冲液平衡的 色谱柱 ，用10 mol/L pH7.4磷酸缓冲液淋洗，1 min收集1管，同抗体反应后，取结合率高而非 特异低的管作为标记成功的IL-8，经3% BSA倍比稀释后分装保存于-20℃。
1.4 放射免疫分析［1，6］ 将标准IL-8(0.2，0.6，1.2， 2.4，4.8和9.6 ng/ml)和待测样品100 μl，同兔抗血清或豚鼠抗血清100 μl以及标记IL - 8 100 μl(20 000 cpm/min)混匀后于4℃放置24 h，加PR试剂(驴抗兔或羊抗豚鼠IgG抗 血 清和聚乙二醇的混合剂)500 μl，混匀后置室温下 15 min，经3 500 r/min离心15 min，弃 上清，测 定沉淀的放射性，经放免分析专用软件处理和计算各点结合率(B/B0%)，绘制标准曲线并给 出样品的浓度。
1.5 HL-60细胞培养上清中IL-8的测定 将对数生长期的大约106的HL -60细胞放入24孔板，分别加入A23187(1 μmol/L)、PMA(1 nmol/L)和LPS(1 μg)， 作用1、3、6、12和24 h，收集上清液贮存于-20℃待测。
1.6 兔失血性休克再灌注复苏后血清中IL-8的测定［7］ 经无菌分离动脉放血造成失血休克60 min，再灌注所放出的抗凝血液及平衡液，造成失血性休克再 灌注损伤，分别取损伤后30 min、2 h、6 h和24 h各时间点动物血清和伤前自身血清。贮存待测。
1.7 正常人血清的分离和培养 取正常查体者血清64人份，贮存待测。
2 结果
2.1 方法学研究
2.1.1 标准曲线 在IL-8为0.2～9.6 ng/ml之间，兔和 豚鼠的抗血清能形成良好的线性关系。见图1。
图1 白介素8放射免疫分析标准曲线
Fig.1 The standard curve of IL-8 radioimmunoassay
2.1.2 灵敏度和精密度 按B0±2s计算，最小可测值为0.1 ng/ ml。 另外，一次测定3例人血清各6份，批内CV为小于5%，一份样品分别测5次，批间CV为9.6% 。
2.1.3 特异性和准确性 2种抗血清同TNF、IL-1、IL-2、IL-6、 GM- CSF在25～200 ml/P1范围内均无交叉反应。分别在每毫升血清中加入0.3、1.2、4.6 ng I L -8标准后，回收率为95.4%～109.0%，取IL-8含量较高的血清以及标准IL-8(Sigma)作1/2 ～1/32的倍比稀释，测定值和稀释倍数间有良好的线性关系。
2.2 正常人血清中IL-8水平 健康人血清中IL-8的平均值为(0.35±0.01 )ng/ml。
2.3 HL-60细胞培养上清液中IL-8的测定 如表1所示HL-60细胞在体 外培 养过程的1～24 h内，血清中IL-8水平逐渐增高，钙离子载体A23187和LPS存在情况 下，可促进HL-60细胞释放IL-8。蛋白激酶阻断剂PMA(佛波脂)不能促进IL-8的释放。
表1 A23187、PMA和LPS体外刺激HL-60细胞后不同时间上清液中IL-8水平(ng/ml)
Tab.1 The IL-8 level of culture supernatant
in HL-60 cell stimulated b y A23187,PMA and LPS
at different time in vitro(ng/ml)
| 1 h | 3 h | 6 h | 12 h | 24 h | ||
| Control | (n=6) | 0.32±0.04 | 0.54±0.07 | 0.62±0.05 | 0.92±0.07 | 1.15±0.24 |
| A23187 | (l μmol/L) | 0.33±0.04 | 0.61±0.09 | 0.89±0.071) | 1 .30±0.091) | 2.78±0.091) |
| PMA | (l nmol/L) | 0.28±0.07 | 0.37±0.09 | 0.45±0.07 | 0.82±0.05 | 1.13±0.15 |
| LPS | (l μg/ml) | 0.29±0.10 | 0.59±0.04 | 0.97±0.051) | 1.92±0.08 1) | |
Note:Compared with control,1)P＜0.01,by t test
2.4 兔失血性休克再灌注复苏后血清IL-8的变化 同伤前自身对照血样相 比较，兔失血性休克再灌注复苏后30 min IL-8开始显著上升，于复苏后2 h达最高，6 h 仍明显高于伤前水平，第24 h即恢复到正常水平，如表2所示。
表2 兔失血性休克再灌注损伤后不同时间 血清中IL-8水平
Tab.2 The IL-8 level of rabbit serum after hemorrhegic shock
and repe rfusion injury at different time point
| n | IL-8 | t val ue | P value | |
| Pre-injury | 52 | 0.559±0.222 | ||
| 30 min | 52 | 0.828±0.3541) | 4.826 | ＜0.001 |
| 2 h | 52 | 0.925±0.3781) | 6.268 | ＜0.001 |
| 6 h | 52 | 0.850±0.4051) | 4.737 | ＜0.001 |
| 24 h | 40 | 0.651±0.321 | 1.678 | ＞0.05 |
Note:Compared with the pre-injury group,1)P＜0.001,by t test3 讨论
IL-8是一种首先发现于LPS刺激人单核细胞后释放的10 kD的多肽，被称为中性粒细胞激活 因子，在感染和炎症过程中发挥重要作用。由于正常人血清和体液中IL-8含量极低，一般 的免疫方法不能检测出其水平。国外目前有高灵敏的酶联免疫分析技术，但药盒售价不适 于国内的广泛使用。我们通过人工重组的IL-8免疫兔和豚鼠，获得了高特异性和高滴度的抗 血清。在此基础上，采用125I标记IL-8，建立了高灵敏度的放免分析方法。经过多 种条件的摸索，确定以平衡法，4℃温育24 h，最后加PR试剂分离游离和结合的抗原成份， 可获得良好的实验结果。同时，我们还对标记抗原、标准抗原以及抗体进行了室温、4℃和 冷冻干燥后保存的各种实验，确定碘标记抗原在冷冻干燥后于室温能保持2个月，标准抗原 和抗 体冻干后在室温下可放置半年，-20℃下置放2年都能保持良好的曲线形态。为验证该方 法的 可靠性，我们分析了64例正常人血清均能测出IL-8含量，平均值位于标准曲线的第1和第2 点之间。在HL-60细胞体外培养加外源性刺激实验中，证明LPS和钙离子载体A23187 能 明显促进HL-60细胞释放IL-8，表明该方法可灵敏检测细胞培养上清液中IL-8水平的差异 。 另外，IL-8分子的构成在不同种属之间有很强的同源性，也就是说抗人IL-8的抗体也能同 其它哺乳类动物的IL-8交叉反应［2］。为此，我们又测定了兔失血性休克再灌注 复苏后不同时间点和伤前自身对照血清IL-8的浓度，但此时使用的是豚鼠的IL-8血清，不 能使用兔IL-8抗血清，同时，分离剂PR试剂中所含的第二抗体也必须是驴抗豚鼠IgG的抗体 。结果显示损伤后兔血清中IL-8水平30 min即显著上升，2 h达高点，然后逐渐下降恢复于 正常水平。该结果表明：该法可用于兔血清中IL-8含量变化的检定；IL-8于失血性休 克再灌注损伤中的迅速上升可能同其激活和趋化中性粒细胞有关，同前期文献中报道的烧伤 病人血清中IL-8初期即明显升高及中性粒细胞激活相一致［4，5］。
总之，该法介绍了一种实用、简便、灵敏和特异的血清及培养液中IL-8的免疫分析方法， 对今后继续探讨IL-8在感染、炎症以及创伤休克机理方面提供了一种可靠的新手段。
本课题为国家自然科学基金资助项目(No.39770716)
作者简介：颜光涛，男，39岁，研究员，硕士生导师，主要从事炎症机理研究
4 参考文献
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7，颜光涛，郝秀华，王录焕 et al.失血性休克再灌注损伤时磷脂酶A 2及其水解产物的变化.中国病理生理杂志，1998；14(4)：141
［收稿1999-08-17 修回1999-11-10］