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膜稳定型TNF突变体的构建、表达及活性研究
中国免疫学杂志 2000年第4期第16卷 分子与细胞免疫学
作者：黄家强 卜夏 李卓娅 龚非力
关键词：膜型TNF-α；基因突变；真核表达；基因直接转移；基因治疗
摘 要 目的：TNF-α可以分泌型(S-TNF)及其前体膜型(M-TNF) 两 种活性形式同时存在于体内。为膜型TNF的转基因应用，构建一种可表达于胞膜而不被酶解 的膜稳定型TNF重组体(mTNFm)。方法：在克隆M-TNF cDNA的基础 上，删除两型TNF转换酶酶解部位的编码序列，构建出mTNFm并测序验证；建立只表达膜型T N F的真核细胞株。结果：Western blot分析及活性测定结果表明，mT NFm不再发生酶切转换且只通过效-靶细胞间直接接触发挥胞毒效应。通过基因直接注射 方式 ，使mTNFm稳定表达于小鼠体内。结论：所构建的mTNFm及其表达细 胞株可用于膜型TNF生物学效应的研究及基因治疗。
中国图书分类号 R371-34
Construction of a human stable transmembrane mutant TNF-α recombinant and its eukaryotic expression
HUANG Jia-Qiang
（Laboratory of Medical Immunology,Beijing Medical University,Beijing 100083）
BU Xia LI Zhuo-Ya
（Department of Immunology,Tongj i Medi cal University,Wuhan 430030）
Abstract Objective： TNF-α exists as bo t h transmembrane form(M-TNF)and secretory form(S-TNF).A kind of M-TNF recombin ant with a stable,uncleavable mutant type(mTNFm)was constructed for its gene therap y.Methods: On the basis of cloning the M-TNF c D NA encoding region,the authors constructed mTNFm,which could potentially expre ss on the c ell surface with a uncleavable type of TNF resulting in deletion of the sequence encoding enzymatic cleavage site of TNF-α-converting enzyme.The cell clones ex pressed mTNFm were selected and identified,and their cytotoxic effect analyzed s ubsequently. Results:mTNFm could express as a s table transmembrane type and act chiefly through cell-to-cell contact.In addit io n, in vivo experiments on mice demonstrated that both the gene mutant and its expression products were persistently present in the local injection sites by d irect gene injection.Conclusion: This table M-Tnf gene mutant clone can be suited for the research of bioactivity and gene therapy of M-TNF.
Key words Transmembrane TNF-α Gene mutati on Eukaryotic expression Direct gene injection Gene therapy
跨膜型TNF-α(Transmembrane TNF,M-TNF)是TNF-α(TNF，下同)编码基因表达的具有活 性的2 6 kD膜结合前体形式［1］。M-TNF可被TNF-α转换酶(TNF-α-converting enzym e,TA CE)酶解产生17 kD的分泌型TNF(Secrectory TNF,S-TNF)［2］。近年来研究表明，T NF的两种形式在受体结合、生物学效应等方面各具特征［3，4］。M-TNF通过直 接 接触在组织局部中发挥效应的特性，有望克服S-TNF在生物治疗应用中引起的远端及全 身性毒副作用。但由于两型TNF可同时存在于体内，影响了对其各自作用特点和生 物学意义的研究及区分。为此，本文在克隆M-TNF cDNA编码序列(mTNF)的基础上，通过删除 TACE的酶解部位编码序列(Val1～Pro12)而构 建出M-TNF的基因突变体(mTNFm)，使之以一 种不被酶解的膜稳定型(M-TNFm)表达于胞膜；建立只表达膜型TNF的真核细胞株，且使M-T NF m在Balb/c小鼠体内获得稳定表达。从而为研究两型TNF的生物学效应及作用机制提供了 体内外实验模型，为M-TNF的基因治疗提供了实验依据。
1 材料与方法
1.1 菌株、质粒和细胞 大肠杆菌XLI-Blue MEF′和穿梭载体pBK -C MV由翦必希博士惠赠；细胞株NIH3T3购自武汉大学中国典型物保藏中心，L929为本室保存。
1.2 实验动物 5周龄Balb/c小鼠，购自江西省动物中心，雌雄各半。
1.3 主要试剂 TRIzol试剂、Superscript逆转录试剂、T4DNA连接 酶、限制性内切酶、G418(GIBCO)，DOTAP转染试剂(Boehringer Mannhein,BRM)，四甲基偶 氮唑盐(MTT,Fluka)，hTNF ELISA检测试剂盒、抗hTNF-α单抗(anti-TNF McAb,北京邦定) ，羊抗鼠IgG荧光标记抗体(SABC)，其他生化试剂均为进口或国产分析纯。
1.4 M-TNF cDNA(mTNF)及其突变体(mTNFm)的引物设计［5］ mTNF扩增引物，P1：5′-GCGGATTC ATGAGCACTGAAAGCATGATCC-3′,P2:5′ -CCC AAGCTTTCACAGGGCAATGATCCCAAAG-3′(划线处分别为Bam HI、Hind III切 点) ；mTNFm扩增引物由一对外侧引物(即P1和P2)和一对内突变重叠引物P6和P7组成，P6：5′- T CA AAC ATG GGC TAC TGC CTG GGC CAG AG-3′,P7:5′-AGC CCT CTG GCC CAG GCA GTA G CC CAT GTT TG-3′。
1.5 mTNF的克隆及测序 常规方法提取LPS(100 ng/ml)刺激4 h的人外周血单核细胞总RNA，逆转录合成cDNA第1条链为模板，PCR扩增mTNF，酶切，定向连接于 pBK-CMV，重组成pBK-mTNF,ABI 373A型DNA 自动测序仪测定克隆片段的核甘酸序列。
1.6 mTNFm真核表达质粒的构建及测序 采用重叠延伸突变PCR法(Mutagenesis by overlapping extension PCR,MOE-PCR)［5］(图1)。模板为pBK-mTNF ， 分别用P1和P6、P7和P2扩增基因片段C、D，PCR条件为：94℃，4 min;49℃，1 min,60℃，3 0 s(片段 C)或1 min(片段D)，72℃，30 s(片段C)或1 min(片段D)，循环28次；72℃，10 min。电泳 回收纯 化片段C、D后，各取1 μg混合作为模板，以上述1对外侧引物P1和P2进行PCR扩增，反应条 件为：94℃，10 min，50℃，10 min；72℃，10 min，共25个循环。电泳回收纯化PCR产物 ，按上述方法构建出mTNFm的真核表达质粒，命名为pBK-mTNFm并测序。
图1 TNF表达质粒的构建及鉴定
Fig.1 The construction and identification of TNF recombinants
1.7 细胞转染及筛选［6］ 按DOTAP试剂盒和说明将pBK-mTN F 、pBK-mTNFm及其对照pBK-CMV转入NIH3T3细胞，继续培养48 h后，分别取部分细胞培养于 8孔 玻片(BRM)进行间接免疫荧光检测。其余细胞按1×105个/孔接种于24孔培养板内，加选择 培养基，3 w后选择培养基逐渐减量，4 w后减至一半，并用有限稀释法对阳性克隆进行亚 克隆。
1.8 克隆细胞株表达产物的鉴定
1.8.1 表达产物生物活性的检测与筛选 采用MTT法。收集1×106 转 染细胞培养上清检测上清(S-TNF)对靶细胞L-929的细胞毒活性［7］；转染细胞用1 % 多聚甲醛固定10 min，PBS洗3次，按效：靶比例10∶1加入L-929，参照文献 ［8］检测膜结合型TNF(M-TNF)对靶细胞L-929的胞毒活性。
1.8.2 表达产物的Western-Blot分析［6］ 转染细胞传代 培 养24 h后，收集1×106细胞及其培养上清(Amicon浓缩器离心透析浓缩)，进行Western- Blot分析。
1.9 mTNFm重组体体内表达实验［9］ 将pBK-mTNFm(100 μg /只 )分别直接注射于0.5%布比卡因(50 μl/只)预处理的Balb/c小鼠背部皮下及左后肢股四头肌内，于第7、14、21、30天分别采集外周血血清及注射部位组织；分别用间接免疫荧光法 和PCR检测TNF重组体基因和表达产物；用ELISA检测小鼠外周血血清中重组TNF(hTNF)水平。
2 结果
2.1 mTNFm的构建及鉴定 RT-PCR扩增mTNF，重组成pBK-mTNF，测 序 验证后作为模板，分别以P1和P6、P7和P2扩增基因片段C、D，取片段C、D混合作为模板，通 过外侧引物P1和P2扩增mTNFm(图1)。测序分析证实mTNFm突变成功(图2)。
图2 mTNFm的核苷酸序列测定结果
Fig.2 The nucleotide seqencing result of mTNFm
2.2 mTNFm的真核表达与鉴定 通过检测TNF重组体转染细胞阳性克隆中对L-929的胞毒活性，筛选出活性较高的阳性克隆细胞各1株，分别命名为H-mTNF、H- mTN Fm，并进行Western blot分析(图3)及活性测定(图4)。结果：①H-mTNF的培养上清可检出1 7 kD的单一反应条带，而裂解液可同时检出17和26 kD双反应条带，且其固定细胞及培养 上清均具胞毒效应；②H-mTNFm则仅细胞裂解液可检出26 kD TNF，其培养上清未检出特异 性反应条带，且仅其固定细胞具有细胞毒活性；此外，以上胞毒效应均可被抗hTNF单抗所中 和(图4)。
图3 TNF 重组体转染细胞表达产物的Western Blot分析
Fig.3 Western blot analysis of cell lysates and
supernatants derive d from the NIH3T3 cells
transfected with TNF gene recombinants
Note:M：standard protein molecular weight mark
er(SABC);1.cell lysates of NIH3T3 cells transfected
with pBK-CMV;2.supernatants of NIH3T3 cells transfected
with pBK-CMV;3.cell lysates of NIH3T3 cells transfected
with pBK-mTNF;4.supernatants of NIH3T3 cells transfected
with pBK-mTNF;5.cell lysates of NIH3T3 cells transfected
with pBK-mTNFm;6.supernatants of NIH3T3 cells transfected
with pBK-mTNFm
图4 转染NF基因的NIH3T3细胞对L929细胞的杀伤效应
Fig.4 Cytotoxicitic effect of TNF recombinants
transfected NIH3T3 cells to L929 cell line
2.3 mTNFm重组体的体内表达 在注射后第7至30天，重组mTNFm基 因及其表达产物均持续存在于注射组织局部，而外周血中未检出hTNF(结果均未显示)。
3 讨论
目前，人们对TNF的研究集中在以提高活性、减小毒性为目的的基因修饰上，虽取得了一 些进展［1］，但仍未达到预期目的。对于M-TNF，也只是初步了解其作用特点。直 至 近来的研究才揭示了两型TNF效应差异的分子基础［4］：S-TNF主要结合TNFRI，而M - TNF则是TNFRⅡ 的有效配体并可能通过双受体介导效应，而且可通过“配体传递”(hand-o ff )等方式调节TNF与TNFRI的结合。由于TNFRI主要介导细胞凋亡和触动NF-κB活化，TNFRⅡ 还 与某些细胞增殖有关［10］，以上研究提示主要通过效-靶细胞直接接触产生作用 的M-TNF具有比S-TNF更广的生物学效应。故M-TNF应用于基因治疗等方面潜能巨大。
本文根据TNF的N端结构与功能特点及TACE作用特点［1，2，4］，通过删 除M-TNF的1～12位氨基酸而构建出mTNFm，建立其稳定表达细胞系；且使mT NFm在Balb/c小鼠 体内获得稳定表达。从而为比较研究两型TNF生物学效应的作用机制及其基因治疗应用提供 了体内外实验模型。
目前国内外尚无文献报道通过裸露DNA的方式在动物体内表达M-TNF。本实验为M-TNF转 基 因治疗肿瘤提供了以下实验依据：①通过基因直接注射方式，可使局部组织持续表达M-TNF ，可克服外源性TNF蛋白直接注射入体内后半寿期过短的缺点；②M-TNF主要在局部通过细 胞间接触发挥效应，可避免S-TNF的全身性毒副作用。
本课题受国家自然科学基金资助（(No.39270314)
作者简介：黄家强，男，33岁，博士后，研究方向为分子免疫；
李卓娅，女，45 岁，教授，博士生导师，研究方向为分子免疫
黄家强（北京医科大学免疫系分子免疫室，北京100083）
卜夏（同济医科大学免疫学教研室，武汉430030）
李卓娅（同济医科大学免疫学教研室，武汉430030）
龚非力（同济医科大学免疫学教研室，武汉430030）
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［收稿1998-10-07 修回 1999-03-17］