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抗U1RNP/Sm 抗体诱导人淋巴细胞凋亡的研究
中国免疫学杂志 2000年第5期第16卷 临床免疫学
作者：郭大文 李晓军 虞伟 武建国
单位：郭大文（第二军医大学研究生院，上海 200433）；工作单位：沈阳军区总医院检验科，沈阳110015；李晓军（南京军区南京总医院全军医学检验中心， 南京 210002）；虞伟（南京军区南京总医院全军医学检验中心， 南京 210002）；武建国（南京军区南京总医院全军医学检验中心， 南京 210002）
关键词：抗U1RNP/Sm 抗体；淋巴细胞；细胞凋亡
摘 要 目的：研究抗U1RNP/Sm 抗体与人淋巴细胞凋亡的关系 。方法：将抗U1RNP/Sm自身抗体与人淋巴细胞共育，37℃ 48 h后用电 镜 观察抗体作用细胞凋亡的形态学改变；瑞氏-姬姆萨染色观察细胞凋亡率，并与流式细胞术 进行比较。结果：电镜观察发现与抗U1RNP 或抗Sm抗体共育后的淋巴细胞发生典型凋亡形态学改变，瑞氏-姬姆萨染色计数凋亡率分别 为(9.95±2.15)%和(15.72±3.20)%，显著高于对照组（P＜0.01），流式细胞术检测结 果与 形态学方法相符。DNA电泳出现典型梯状条带。结论：抗U1RNP /Sm 抗体具有诱导淋巴细胞凋亡的能力。
中国图书分类号 R392.11
Effects of anti-U1RNP/Sm antibodies on apoptosis of human lymphocytes
GUO Da-Wen
（The Graduate Institute, Second Military Med ical University,Shanghai 200433）
LI Xiao-Jun YU Wei WU Jian-Guo
（Department of Immunology, Center of Medical Laboratory Science of PLA, Nanjing General Hospital of Nanjing Command ,Nanjing 210002）
Abstract Objective：Study of the effect of anti-U1RNP/Sm antibodies on apoptosis of human lymphocytes.Methods: The ultrastructural f eatures of apoptosis were observed with electron microscope and the percentages of apoptosis were measured by Wright-Geamsa staining.The correlation between th e results of staining and those of FACS analysis was compared.Results: Ultrastructural observations with electron microscope show ed characteristic features of apoptosis and the percentages of apoptosis measure d by Wright-Geamsa staining were notably increased compared with the controls〔
Key words Anti-U1RNP/Sm antibodies Lymphocyte Apopto sis
抗U1RNP抗体是混合性结缔组织病（MCTD）的特征性标志和诊断指 标之一,亦见于全身性红斑狼疮（SLE）、干燥综合征（SS）等患者。抗Sm抗体则只见于SLE 患者，是SLE的 标志性抗体。二者相应的抗原分别为U1RNP和U1、U2 、U4/U6、 U5 RNP 。早 期 研究表明，抗RNP抗体可穿入活的淋巴细胞，清除T抑制细胞，引起免疫抑制功能低下而引发 抗核抗体的产生［1,2］。本文报道了对抗U1RNP/Sm自身抗体与细胞凋亡关系的 研究结果。
1 材料与方法
1.1 研究对象 阳性标本均获自我院诊断明确的门诊及住院患者 。免疫印迹和ELISA法筛选仅抗U1RNP 抗体阳性，其余抗ENA多肽抗体、抗ds-DNA抗体、A N A均阴性的MCTD（4例）、SLE（4例）血清和仅抗Sm 抗体阳性，其余抗ENA多肽、抗ds-DNA 抗 体、ANA均阴性的SLE（5例）血清。淋巴细胞和正常对照血清（6份）来自健康献血员。所有 血清标本均用50%饱和度硫酸铵盐析，提取γ球蛋白（γG）组分，免疫比浊法测定IgG含量 ，0.22 μm微孔滤膜除菌，-20℃保存。
1.2 细胞分离与培养 按常法用淋巴细胞分离液（上海试剂二厂） 从正常人新鲜外周血中分离单个核细胞，RPMI1640（GIBCO）培养基洗3次，重悬于含10% 小牛血清-RPMI1640培养基中，调整细胞密度为1×106～2×106 ml-1，台盼蓝 拒 染率＞96%。移入24孔培养板，1 ml/孔。实验分2组：A组各孔加抗U1RNP/Sm 抗体或正常 对 照血清γG，终浓度为1 mg/ml。B组各孔加PHA（100 μg/ml），培养48 h后加入上述浓 度的抗U1RNP/Sm 抗体或正常对照血清γG。于37℃、5%CO2温箱中培养48 h。
1.3 瑞氏-姬姆萨染色观察 培养细胞用1%戊二醛固定，瑞氏-姬 姆 萨染色，光学显微镜检查。凋亡细胞体积缩小，细胞膜有出芽现象，可见凋亡小体，核固缩 ，可成新月形或块状，核内可见空泡。2人双盲观察，计数200个以上细胞，计算凋亡 率（Ap%）。
1.4 电镜观察 细胞（1×107）用2.5%戊二醛固定2 h，1%锇酸 固定 1 h，树脂包埋，超薄切片，醋酸铀、枸橼酸铅染色，日立JEM1200-EX透射电镜观察。
1.5 流式细胞术检测 采用细胞凋亡检测试剂盒Annexin V-FITC kit（ 深圳晶美公司）及美国BD（Becton Dickinson）公司的流式细胞仪FACScalibur 检测细胞凋 亡。
1.6 核酸电泳 洗涤培养细胞，重悬于200 μl TES（15 mmol/L Tr is·HCl，15 mmol/L EDTA，15 mmol/L NaCl，pH8.0）中，加40 μl 5 mol/L NaClO4， 充 分混匀，加100 μl 10% SDS，37℃ 10 min，然后转入65℃ 15 min。等体积酚、氯仿、异 戊醇（V∶V∶V= 25∶24∶1）抽提，上清加1/10体积3 mol/L NaAc和2倍体积冰冷乙醇沉淀D NA。于含EB的1.5%琼脂糖凝胶中电泳，85 V 60 min，紫外光下拍照记录。
1.7 统计学方法 成组计量资料t检验，直线相关回归分析。
2 结果
2.1 电镜结果 显示抗U1RNP/Sm 抗体可诱导细胞凋亡，凋亡细胞核固缩，染色质聚缩，凋亡小体形成（图1）。
2.2 瑞氏-姬姆萨染色结果 观察典型凋亡细胞，计算凋亡率，结果 见表1。
2.3 流式细胞术(FACS)检测结果 细胞凋亡后，磷脂酰丝氨酸(PS )由细 胞膜内侧转到外侧，与annexinⅤ-FITC结合，嗜DNA荧光染料碘化丙啶（PI）只通过坏死或 破损细胞膜而不能通过完整细胞膜，结果见图2。
图1 抗U1RNP/Sm抗体诱导人淋巴细胞凋亡 的电镜照片（8 000×）
Fig.1 Electronmicrograph of the human lymphocytes incubated
with anti-U 1RNP /Sm antibodies(8 000×)
Note:The cell on the left is normal, the cell on the right is a n apop totic one with cytoplasm shrinkage and nuclear condensation
表1 抗U1RNP/Sm抗体诱导人淋巴细胞凋亡
Tab.1 Apoptosis of human lymphocytes induced by anti-U 1RNP /Sm antibody
| Groups | n | Apoptosis（%） | |
| A | B | ||
| Anti-U1RNP antibody | 8 | 9.95±2.151) | — |
| Anti-Sm antibody | 5 | 15.72±3.201) | 16.72±2.131) |
| Normal control γG | 6 | 2.82±1.19 | 4.00±1.30 |
note:1)vs normal control,P＜0.01；A：PHA（-），B：PH A（+）
图2 FACS 结果
Fig.2 FACS analysis of lymphocytes apoptosis
Note:Dots in the low-right corresponds to apop totic cells, which in the example sho wn accounted for 12.78%,20.83% and 23.61% of cells incubated with (A): nor mal control γG,(B): anti-U1RNP antibody and (C):anti-Sm antibody
图3 瑞氏-姬姆萨染色法与FACS法检测细胞凋亡相 关性（n=10）
Fig.3 Correlation between apoptosis as measured
by Wright-Geamsa staini ng and as measured by FACS analysis （n=10）
图4 DNA电泳结果
Fig.4 DNA fragmentation assay
Note:lane 1.DNA isolated from cells incubated with human anti-U1RNP ant ibody;lane 2.DNA isolated from cells incubated with human anti-Sm antibody;lane 3.DNA extracted from cells cultured in the normal human γG
2.4 瑞氏-姬姆萨染色法与FACS法的相关性 FACS与瑞氏- 姬姆萨染色 检测细胞凋亡结果的相关性见图3。两法结果的相关系数r=0.841 7，P＜0.01， 成正直线相关。
2.5 DNA电泳 可见与抗U1RNP或Sm抗体共育的淋巴细胞出现典型梯状 条带（图4）。
3 讨论
早期发现某些自身抗体可穿入活细胞，影响细胞功能［3,4］，后又相继发现某些自 身抗体能够诱导细胞凋亡从而引发免疫功能紊乱［5-8］，我们曾发现 抗钙调素自身抗体 虽可进入活的淋巴细胞但并不能诱导细胞凋亡。但有关一些重要的抗核抗体与淋巴细胞凋亡 的关系目前国内外均少见有关报道。本课题以MCTD和SLE患者体内特征性的自身抗体——抗U 1RNP /Sm 抗体为研究目标，探讨这2种自身抗体与细胞凋亡的关系。
抗U1RNP/Sm 抗体的靶抗原RNP是细胞内功能不同的RNA分别与相应蛋白结合成的复 合体，参与mRNA转录后的剪切加工过程，RNP功能受阻会引起细胞功能改变。我们将淋巴细 胞与抗U1RNP 和抗Sm 抗体共育48 h，细胞凋亡率（9.95±2.15）%和（15.72±3.20）%与 正常对照（2.82±1.19）%相比显著升高（P＜0.01）。
抗U1RNP/Sm 抗体诱导细胞凋亡的可能机制为抗U1RNP/Sm IgG穿入活的淋 巴细胞而与细胞内、核内的靶抗原发生作用；抗U1RNP/Sm IgG结合在淋巴细胞表面 相应的靶抗原或与之有交叉反应的分子上。间接免疫荧光实验发现，抗U1RNP/Sm I gG既可结合在细胞膜上，又能进入细胞内。抗RNP抗体进入细胞的方式至今尚无一致结论， 经由 IgG的F(ab′)2、Fc部分介导及其他一些入胞方式均有报道［4,9］，推 测不同亚类的IgG 对不同的细胞可能有各不相同的入胞方式。U1RNP 多肽及其异二聚体还可出现在某些淋巴 细 胞表面［10］，这意味着抗U1RNP 抗体除了进入细胞与靶抗原结合直接干扰m RNA成熟外，还可结合在细胞表面，通过细胞内的信号转导途径而干扰细胞活动。抗U1RNP / Sm 抗体引起培养的人淋巴细胞凋亡，使更多的核抗原暴露于机体免疫系统，产生更多的自 身抗体［11,12］，同时引起MCTD、SLE患者外周血淋巴细胞减少，结果使患者病情更 加趋于活动。结缔 组织病 （CTD）患者的淋巴细胞在体外凋亡率增加［13,14］，可能是由于患者体内 淋巴细胞处于高活 化状态［15］，而活化细胞比静止细胞对凋亡刺激更加敏感的原因［16］ 。我们也发现PHA活化的 淋巴细胞凋亡率略有增高，推测有活化诱导的凋亡（AICD）机制参与其中。
本研究在国内外首次阐明抗U1RNP /Sm 抗体具有诱导淋巴细胞凋亡的能力 。这一现象为进一步揭示某些自身抗体的作用机制及自身免疫病如MCTD、SLE的发病机理均 具有重要的指导意义。自身抗体诱导淋巴细胞凋亡的能力一方面对机体造成免疫损伤，另一 方面可能是机体试图限制自身免疫进程的一种自我保护机制，因而具有重要的病理和生理意义。
作者简介：郭大文，女，29岁，第二军医大学实验诊断学专业硕士研究生；
李晓军 指导教师，女，38岁，硕士，副主任技师；武建国 指导教师，男，64岁，主任医师，教授
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［收稿1999-03-23 二次修回1999-10-26］