鼻咽癌中生长因子/细胞因子mRNA差异表达分析

鼻咽癌中生长因子/细胞因子mRNA差异表达分析

中国免疫学杂志 2000年第8期第16卷 临床免疫学

作者：谢鹭　许亮国　蓝轲　何志巍　李官成　姚开泰

单位：谢鹭（湖南医科大学卫生部癌变原理重点实验室，长沙 410078）；许亮国（湖南医科大学卫生部癌变原理重点实验室，长沙 410078）；蓝轲（湖南医科大学卫生部癌变原理重点实验室，长沙 410078）；何志巍（湖南医科大学卫生部癌变原理重点实验室，长沙 410078）；李官成（湖南医科大学卫生部癌变原理重点实验室，长沙 410078）

关键词：鼻咽癌；生长因子；细胞因子；cDNA阵列

　　摘　要　目的：考察鼻咽癌中差异表达的生长因子/细胞因子，推测鼻咽癌发生中可能存在的免疫机制。方法：采用cDNA阵列杂交技术，同时对98个己知与肿瘤相关的生长因子/细胞因子在鼻咽癌、正常鼻咽组织及其他几种头颈部鳞癌中的mRNA表达水平进行筛查，筛选出在鼻咽癌中差异表达的生长因子/细胞因子基因。结果：在鼻咽癌中上调的基因包括：早期生长应答蛋白1，肝癌来源生长因子，白介素1β，血小板来源生长因子A链，干细胞因子，畸胎瘤来源生长因子，干扰素诱导肽、蛋白，干扰素调节因子及干扰素受体等；在鼻咽癌中下调的基因有：TGF-β 2等。结论：鼻咽癌细胞可能自分泌或促进分泌大量生长因子，鼻咽癌侵润淋巴细胞分泌的细胞因子主要为Th1细胞型。

　　中国图书分类号　R392.11

mRNA differential expression analysis of growth factors and cytokines in nasopharyngeal carcinoma

XIE Lu，XU Liang-Guo，LAN Ke et al.

　　Cancer Research Institute，Hunan Medical University，Changsha 410078

　　Abstract　Objective:To investigate the differentially expressed growth factors and cytokines in nasopharyngeal carcinoma(NPC)，thus to get an implication to possible immunological mechanism that may be involved in the development of NPC.Methods:cDNA array hybridization technique was used to screen the expression of 98 growth factors and cytokines known to be related to tumor biology，in the tissues of NPC，normal adult nasophargyngeal tissue，and several other head and neck squamous cell carcinomas.Results:Genes which were up-regulated in NPC include:early growth response protein 1，hepatoma-derived growth factor，IL-1β，platelet-derived growth factor A chain，stem cell factor，teratoma-derived growth factor 1，IFN inducible peptide，protein，IFN regulatory factor，IFN receptors，et al.Genes which were down-regulated in NPC include TGF-β2 et al.Conclusion:Nasopharyngeal cancer cells may self-secrete or pro-secrete many growth enhancers.The cytokines secreted by the infiltrating lymphocytes in NPC are maily Th1 type.

　　Key words　Nasopharyngeal carcinoma　Growth factors　Cytokine　cDNA array

　　生长因子(Growth factor，GF)是具有刺激细胞生长作用的一类由细胞产生的多肽类因子。免疫细胞产生的多种细胞因子也具有刺激细胞生长的作用，从这个意义上讲，它们也是生长因子。似乎可以认为生长因子是具有刺激细胞生长活性的细胞因子(Cytokine)^［1］。对于细胞因子的研究一直是生物医学的热门领域，发表的论文每年逾万篇^［2］。细胞因子在肿瘤免疫中的研究倍受重视。在鼻咽癌中虽进行过多种细胞因子的检测和分析，但究意有多少已知的生长因子、细胞因子可能与鼻咽癌的发生或发展相关，尚无人进行过考察。我们采用新型的cDNA阵列杂交技术，同时对98个已知与肿瘤相关的生长因子、细胞因子在鼻咽癌中的mRNA表达水平进行筛查，对照正常鼻咽组织及其他几种头颈部鳞癌，从更全面的角度检测哪些因子可能与鼻咽癌相关，为鼻咽癌的免疫机理研究和免疫治疗的靶分子选择提供新的思路。

　　1　材料与方法

　　1.1　标本来源　低分化鼻咽鳞癌活检组织26例，鼻咽癌对侧正常活检组织9例。咽癌组织5例，喉癌组织9例，口腔癌7例，上颌窦癌5例，均为鳞癌手术标本。由湖南省肿瘤医院及湘雅医院提供。

　　1.2　Atlas^TM Human Cancer cDNA Expression Array(CLONTECH)　两套一式4张膜。膜分A、B、C、D、E、F六区，F区为98个(14×7)生长因子/细胞因子的cDNA点阵，为我们分析的对象。每一cDNA为经基因特异引物PCR扩增(200～600 bp长，无重复序列和polyA尾)、部分测序证实后双份打点于尼龙膜上，对应于相应的基因。膜底部设有阴性对照、空白对照和阳性内对照(看家基因)，为G区。在底线及右侧点有基因组DNA作为定位框。

　　1.3　鼻咽癌、成人鼻咽及几种头颈部鳞癌肿瘤相关基因表达谱的建立　总RNA提取：照TRIzol^TM Reagent(GIBCOL BRL)说明书进行。去除总RNA中的量DNA：用DNase I(GIBCOLBRL)消化。放射性标记cDNA探针合成：根据Atlas^TM Human Cancer cDNA Expression Array用户手册进行，初始总RNA 5 μg，放射性同位素α-³²P标记dATP(10 μCi/μl，北京亚辉生物工程公司)50 μCi，Sephadex G-50(华美公司)柱分离标记好的cDNA探针。杂交：试剂盒提供的杂交液68℃预杂交2 h，换杂交液加标记cDNA探针68℃杂交过夜。洗膜：2×SSC，1%SDS，68℃ 20 min 洗2次；0.1×SSC，0.5%SDS，68℃ 10 min 洗2次。放射自显影：AGFA胶片，YEZ-ELB400型增感屏，-70℃曝光3～7 d。

　　1.4　结果分析　放射自显影基因表达谱经Eagle Eye II still video system(Startagene)图像分析仪测定累积光密度值(integrated density，ID)，以看家基因泛素(Ubiquitin)ID值为对照，设其值为10，得出其他基因的相对ID值。我们将在鼻咽癌中相对ID值与正常鼻咽相差超过30%的基因定为有表达差异。

图1　cDNA 阵列F区生长因子/细胞因子mRNA在6种组织中的差异表达分析

　　Fig.1　cDNA array F quadrant expression pattern of growth factors/cytokines

　　Note:Ⅰ.normal nasopharyngeal tissue;Ⅱ.nasopharyngeal carcinoma;Ⅲ.hypopharyngeal carcinoma;Ⅳ.laryngeal carcinoma;Ⅴ.oral cavity carcinoma;Ⅵ.maxillary sinus carcinoma.The block bar shows G area，from left to righe indicates:G15-blank spots;G16、G17、G18-negative controls，M13 or PUC DNA spots;G19、G20、G21:Positive controls，spotted by house-keeping genes such as β-actin.The dots at the bottom of G and right row are genomic DNA spots for the location of the atlas.The arrow demonstrates an example:teratoma-derived growth factor(TDGF) 1 only expressed in nasopharyngeal cancer and oral cavity cancer

表1　生长因子/细胞因子相关基因在鼻咽癌中差异表达情况

　　Tab.1　Growth factors/cytokines differentially expressed in nasopharyngeal cancer

Gene(Location，title，GenBank#)		Relative integrated density value of expression level
		MP	NPC	PC	LC	OCC	MSC
F1f：BIGH3	M77349	6.293	9.090	8.716	9.252	10.523	8.823
F1h:BMP2A	M22489	0	5.013	0	0	0	0
F3e：GMF-β	M86492	0	7.480	0	0	0	0
F3g:TGF-β2	M19154	6.547	0	0	0	0	0
F3j:EGR-1	M62829	4.048	7.664	7.558	9.210	9.279	8.616
F3l：hepatoma-derived GF	D16431	5.958	8.187	7.888	8.951	8.744	8.692
F4g：IL-1β	K02770	0	9.334	0	0	0	0
F5l：IFN-inducible peptide	X02492	0	8.194	0	8.920	8.915	0
F5n：MIF	M25639	3.895	6.721	7.592	0	0	0
F6e：PDGFA chain	X06374	5.089	8.272	0	8.994	8.824	0
F6g:SDF1A	L36034	8.014	0	0	0	0	0
F6i：Stem cell factor	M59964	0	7.638	0	0	0	0
F6k:TDGF1	M96956	0	7.781	0	0	8.553	0
F7b:TGF-β	X02812	0	7.464	0	0	0	0
F7f：IFN-γRβ chain	U05875	5.573	7.806	0	8.935	0	0
F7g：IRF	X14454	5.574	8.480	0	9.063	0	0
F7j：IFNα-βRβ	X77722	0	7.738	0	0	0	0
F7k:IFN-γRα chain α	J03143	0	7.593	0	0	0	0
F7n:IFN-γinduced protein	X02530	0	9.592	0	9.280	8.469	0

　　Note:NP:normal nasopharynx;NPC:nasopharyngeal carcinoma;PC:pharyngeal carcinoma;LC:Laryngeal carcinoma;OCC:oral cavity carcinoma;MSC:maxi llarysinus carcinoma

　　2　结果

　　成人鼻癌、鼻咽癌、咽癌、喉癌、口腔癌及上颌窦癌的98个肿瘤相关生长因子/细胞因子cDNA表达阵谱见图1。98个基因中在正常成人鼻咽和/或鼻咽癌中有表达的共有25个，有表达差异的共20个，其在各种肿瘤中的相对累积密度值列于表1。

　　3　讨论

　　如将ID值相差超过30%的基因定为有表达差异，则在鼻咽癌中上调的基因包括：TGF-β诱导基因(BIGH3)，胶质成熟因子β(GMF-β)，骨成形蛋白(BMP)2A，早期生长应答蛋白1(EGR-1)，肝癌来源生长因子，白介素1β(IL-1β)，巨噬细胞移动抑制因子(MIF)，血小板来源生长因子A链(PDGF A chain)，干细胞因子(SCF)，畸胎瘤来源生长因子又称类上皮生长因子TDGF1，转化生长因子β(TGF-β)，白细胞干扰素(IFN)诱导肽，γ干扰素诱导蛋白(IFN-γ IP)，干扰素调节因子(IRF)，γ干扰素受体α链(IFN-γRα)，γ干扰素受体β链(IFN-γRβ)，干扰素α-β受体β链(IFNα-βRβ)。其中有一些基因的功能比较明确，如：GMF-β为神经胶质生长因子，与细胞间联系和信号传递有关。BMPs是信号分子TGF-β超家族中高度保守的成员，对正常发育尤其是骨形成起关键作用。原位杂交和免疫组化显示BMP2在胰腺癌组织中显著高表达，并与术后生存时间短相关^［3］。IL-1β与肿瘤关系较密切，在多种肿瘤中表达水平增高^［4］。MIF巨噬细胞移动抑制因子在前列腺肿瘤中mRNA过表达，TGF-β，b-FGF，PDGF均能显著上调MIF mRNA表达水平。因此，MIF可能与其他生长因子共同作用诱导肿瘤细胞生长，从而可以设想用抗MIF抗体和MIF反义质粒转染作为肿瘤免疫治疗的新途径^［5］。畸胎瘤来源生长因子是在早期胚胎发育过程中表达的一种分泌型生长因子，在某些肿瘤如乳腺癌和结肠癌中又重表达^［6］。还有一大类是干扰素调节诱导基因和受体基因，可能与生长因子的信号传递有关。如干扰素调节因子(IRF)为一转录因子，能与I型干扰素和干扰素诱导基因的启动子区DNA序列元件结合，因此IRF基因的上调可导致许多干扰素诱导基因的产生^［7］。干扰素诱导蛋白10(IP-10)是C-X-C趋化因子家庭成员之一，对单核细胞、T细胞和平滑肌细胞具潜在趋化吸引作用^［8］。IFN alpha-beta(I型)受体β链胞浆区近端酪氨酸是转录子STAT2活化所必需的信号传递子和活化子^［9］。IFN-γ受体(II型)β链与IFN-γ受体α链可能并存于某些细胞，在与配体IFN结合后形成受体复合物，可激活下游JAK-1信号传递途径^{［10，11］}。另外如EGR-1，肝癌来源生长因子PDGF A chain也是比较明确的促生长因子。TGF-β也上调，TGF-β家族具有促进生长和抑制生长的双重作用，具体如何尚要分析其所处的哪条通路被活化。有些基因的意义不太明确，如BIGH3为-TGF-β诱导基因，其突变与角膜营养失调有关，在鼻咽癌中有较弱上调。

　　在鼻咽癌中下调的基因有：TGF-β2，Pleiotrophin precursor(PTN)，间质细胞来源因子1(SDF1A)(前B细胞刺激因子)。TGF-β2属于TGF-β家族，但多报道为生长抑制因子，在肿瘤细胞中表达下调^［12］。

　　综上所述可知，在鼻咽癌中生长因子/细胞因子的改变是错综复杂的，说明有多种生长因子、生长抑制因子及它们的受体在侵润性鼻咽癌中有表达，很可能还有自分泌和旁分泌环的形成。如干扰素基因及其受体系列。其他头颈部鳞癌相应基因的表达情况有少数呈现与鼻咽癌符合的趋势，但大多数基因在不同肿瘤中呈现不同的分布，这在选取基因作进一步的免疫机理或免疫治疗研究时具有重要的参考价值。

　　另外在鼻咽癌中上调的细胞因子主要为Th1细胞型，如IL-1β、IFN，说明鼻咽癌中细胞免疫的水平较高。鼻咽癌是一种有明显淋巴细胞侵润的癌，侵润的淋巴细胞中T细胞又占主体。我们的检测也发现前B细胞刺激因子在鼻咽癌中明显下调。T细胞免疫是机体抗肿瘤免疫的主要力量之一，但为何鼻咽癌细胞又能逃脱高水平的细胞免疫监视而持续进展，正是鼻咽癌免疫机制研究中的难点。这可能与鼻咽癌细胞同时自分泌或促进分泌大量促血管生成、促细胞增生的生长因子以及某些发挥生长抑制的效应因子功能不足有关。

　　随着人类基因组计划的不断推进，在已有的数目庞大的细胞因子基础上，免疫新分子也不断地被克隆出来^［13］，结合cDNA阵列，微阵列，芯片等新型基因表达谱技术筛选某一疾病状态的免疫相关因子将成为一种快速高产的途径，可以迅速缩小范围，利于寻找基因与基因间的联系，进行免疫机制的探讨，或寻找有潜在免疫治疗意义的靶基因。

　　国家自然科学基金重点资助项目(39730200)和美国中华医学基金会资助项目(96-655)

　　作者简介：谢　鹭，女，博士；

　　指导教师：姚开泰，男，中国科学院院士，主要研究肿瘤分子病因学

　　姚开泰（湖南医科大学卫生部癌变原理重点实验室，长沙 410078）

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［收稿：1999-09-27修回：1999-12-23］