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血液透析患者外周血中Bcl-2水平检测及临床意义
中国免疫学杂志 2000年第10期第16卷 临床免疫学
作者：齐晖 戴勇 王莎燕 黄瑞芳 彭保 李德萍
单位：齐晖（深圳市人民医院，深圳 518020）；戴勇（深圳市人民医院，深圳 518020）；王莎燕（深圳市人民医院，深圳 518020）；黄瑞芳（深圳市人民医院，深圳 518020）；彭保（深圳市人民医院，深圳 518020）
关键词: 血液透析；Bcl-2；凋亡
摘 要 目的：探讨血液透析病人外周血中 Bcl-2的变化及临床意义。方法：用 ELISA法检测30例血透病人和20例正常人 Bcl-2水平，并与sFas、IL-6和 TNF-α进行比较。结果：血透病人 Bcl-2值( 7.43±2.14 U/ml)显著低于正常对照组( 9.14±2.84)U/ml，P＜0.05；透析后 Bcl-2水平比透析前进一步降低 (6.03±2.01)U/ml ， P＜0.05。血液透析病人 Bcl-2水平与 sFas、IL-6、Cr水平呈明显负相关， r值分别为-0.482、-0.375、-0.363，P＜0.05。结论：血液透析病人外周血中 Bcl-2水平显著降低，可作为衡量血透疗效的一项指标。
中国图书分类号 593.24
Detection and clinical significance of peripheral blood bcl-2 in hemodiasis patients
QI Hui，DAI Yong， WANG Sha-Yan
（ShenZhen People's Hospital, ShenZhen 518020）
Abstract Objective：To investigate the change and clinical significance of peripheral blood Bcl-2 in hemodialysis patients. Methods ： The levels of Bcl-2 in 30 hemodialysis patients and 20 controls were measured with ELISA method, and compared with that of sFas, IL-6, TNF-α. Results ：The Bcl-2 level of the patients(7.43±2.14 U/ml) was significantly lower than that of the normal controls (9.14±2.84 I/ml), P＜0.05. The Bcl-2 value in post-dialysis decreased further (6.03±2.01 U/ml) compared with pre-dialysis, P＜0.05. The correlations of Bcl-2 vs sFas and Bcl-2 vs IL-6 were negative and statistical significance in the hemodialysis patients. Conclusion : The peripheral blood Bcl-2 level of the hemodialysis patients decreases.
Key words Hemodialysis Bcl-2 Apoptosis
Bcl-2基因(B cell lymphoma/Leukemia-2)是 1982年由 Yunis等人从滤泡性 B细胞淋巴瘤病人染色体上发现的一种人类正常基因［1］。 Bcl-2基因位于 18q21.3染色体片段，有 3个外显子和 2个启动子。第一个外显子不表达，第二个外显子与第三个外显子之间有 225 kb的内含子。其基因产物为一种膜蛋白，锚定于核周膜、线粒体外膜、内质网膜。其作用在于普遍保护细胞免受多种刺激诱导的凋亡，维持细胞存活［2］。本研究采用 ELISA方法检测血透患者外周血中 Bcl-2的水平，并与可溶性 Fas (sFas)、白细胞介素 - 6 (IL- 6)和肿瘤坏死因子 -α(TNF-α)几种细胞凋亡调节因子进行比较分析，旨在探讨 Bcl-2在血透病人外周血中的变化及其临床意义。
1 材料与方法
1.1 研究对象 自我院门诊及住院病人中随机选取正在进行维持性血液透析的慢性肾小球肾炎患者 30例（男19例，女11例），平均年龄 42.11±20.64岁。正常对照组 20例（男 6例，女 14例），为我院工作人员和献血者，平均年龄40.25±8.86岁。
1.2 研究方法 患者每2～3天，用日本 Nippon血透机，醋酸纤维膜透析器进行1次血液透析。血透前检测血常规、血液尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)，根据 BUN和 Cr的实测值，在透析液流量 500 ml/min、血流量200 ml/min的基础上做相应增减，设置当日透析液流量和血流量值。于透析前、后分别抽取外周静脉血3 ml，用2%EDTA抗凝，取全血0.25 ml加细胞裂解液处理后-80℃保存，用于 Bcl-2水平测定。其余静脉血2 000 r/min离心，取血浆 -30℃保存，用于检测sFas、IL-6和TNF-α。正常人血标本处理同上。所有样本用酶联免疫分析法（ELISA）检测。Bcl-2试剂盒为美国 ENDOGEN公司生产。sFas、IL-6和TNF-α试剂盒为美国 GENZYME公司生产。于酶标仪 450 nm处读取吸光度值，根据各自标准曲线分别计算 Bcl-2、sFas、IL-6、TNF-α的浓度。
1.3 统计学处理 实验数据用
2 结果
2.1 血透患者外周血中 Bcl-2与sFas、IL-6、TNF-α水平与正常对照组比较 血透病人 Bcl-2水平明显下降，P＜0.05。透析后进一步降低, 与透析前比较差异显著，P＜0.05；sFas、IL-6和TNF-α水平较正常人明显升高，但血透前后变化不明显，见表1。
表1 血透患者外周血中Bcl-2、sFas、IL-6、TNF-α水平(
Tab.1 Levels of peripheral blood Bcl-2, sFas, IL-6, TNF-α in hemodialysis patients (
| Bcl-2(U/ml) | sFas(pg/ml) | IL-6(pg/ml) | TNF-α(pg/ml) | |
| Controls | 9.14±2.84 | 35.15±9.68 | 64.10±21.43 | 114.62±16.88 |
| Hemodialysis patients | ||||
| Pre-dialysis | 7.43±2.141) | 103.36±35.282) | 102.97±33.221) | 136.01±19.061) |
| Post-dialysis | 6.03±2.012)，3) | 105.39±38.842) | 90.25±30.331) | 147.29±31.601) |
note: 1) P＜0.05, 2) P＜0.01 , compared with normal control.3)P＜ 0.05, compared with pre-dialysis2.2 血透患者外周血中 Bcl-2与sFas、IL-6、TNF-α、BUN、Cr的相关性 以血透病人在每次进行透析之前的测定值做为维持性血透治疗期间各有关物质在外周血中的浓度，分别进行 Bcl-2与 sFas、IL-6、TNF-α、BUN、Cr水平的相关性测验。 BUN和Cr在每次透析前的均值分别为30.79±12.42 μmol/L和912.75±361.16 μmol/L, Bcl-2与sFas、IL-6 、Cr水平呈明显负相关关系，r值分别为-0.482，-0.375和-0.363，P＜0.05与TNF-α和BUN相关不显著。
3 讨论
目前， Bcl-2基因倍受重视，在于它对细胞凋亡具有明显抑制作用，且这种作用在于抑制细胞死亡，而非刺激细胞增生［3］。已有实验证明，原发性、继发性肾小球肾炎，狼疮性肾炎，肾毒性肾病，肾移植急、慢性排异反应等肾脏疾病的细胞增生均伴有高水平 Bcl-2表达［4-6］，而且肾小球 Bcl-2表达与肾小球细胞增多呈显著正相关，表明至少肾小球细胞增多的部分原因是由于Bcl-2增多抑制了通过凋亡途径对异常增生细胞的清除［6］。在我们的研究中，慢性肾小球肾炎患者在维持性血液透析期间，外周血 Bcl-2水平明显低于正常人，在每次透析后又比透析前进一步降低。血透后 Bcl-2水平降低可能是炎症恢复期对细胞凋亡的抑制减弱，通过细胞凋亡途径清除异常增生细胞的活动增强，这种改变有利于减轻肾小球损伤。
关于血透患者 Fas水平上调的实验所见，与我们在另一组血透患者所得的结果相同［7］。Fas系统是包括肾细胞在内的实现细胞凋亡的机制之一： Fas与其配体 FasL结合可诱导凋亡，sFas阻滞 Fas与FasL结合从而抑制凋亡，参与肾脏的发生、发育、维持肾固有细胞稳定，以及病理情况下的肾损伤与修复。Sano等报道，增生性肾小球肾炎病人血浆中的 sFas明显升高，并证明它对抑制肾小球细胞凋亡有重要意义［8］。本组患者在接受维持性血透治疗期间，作为保护性反应的 sFas增加，其意义亦可能在于抑制细胞凋亡造成的肾结构损害。TNF-α和IL-6可刺激 Fas基因转录。 Ortiz Arduan在培养的人肾小球系膜细胞看到TNF-α有促进 Fas mRNA 表达的作用［9］。余志远等用反转录多聚酶联反应方法与细胞原位杂交技术均未在正常外周血单核细胞上检测出TNF-α和IL-6的基因表达，而尿毒症非透析患者和尿毒症透析患者均有TNF-α和IL-6基因表达，且透析患者比非透析患者的表达又明显升高［10］。与我们的结果正相吻合。
本组血透患者在血透后 Cr平均水平为912.75 μmol/L,虽比透析前下降，但仍非常明显地高于正常值。血透患者在 Bcl-2降低的同时 Cr处于高水平状态， Cr与 Bcl-2显著负相关的关系提示外周血 Cr浓度的升高可能是激活 Bcl-2下调的因素之一。sFas上升与 Bcl-2下降两项指标同时发生，且呈明显负相关,可能是血透时血液与透析膜接触或透析液中物质进入血液导致单核细胞激活；或者是血透改善尿毒症的内环境，使单核细胞易于接受刺激而被激活，或是涉及更广泛的机制，值得进一步进行研究。
总之，本实验发现，血透患者外周血中的Bcl-2水平下降， sFas、 IL-6、 TNF-α、 BUN、Cr水平升高；Bcl-2分别与 sFas、IL-6、Cr呈显著负相关。据此可将外周血 Bcl-2下降与sFas、IL-6、 Cr升高一同作为衡量血液透析疗效及肾小球肾炎尿毒症预后的一项指标。
作者简介：齐 晖，女，硕士，主要从事细胞学及临床免疫学研究
李德萍（深圳市人民医院，深圳 518020）
参考文献
1，Tompson B. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease. Science, 1995; 267: 1451
2，Korsmeyer S J. Bcl-2 initiates a new category of oncogenes: regulators of cell death. Blood, 1992; 80: 879
3，曾丽霞.Bcl-2基因与肾脏疾病.国外医学*泌尿系统分册，1996；16(4)：241
4，Nakopoulou L, Stefananki K, Papadakis J et al. Expression of Bcl-2 oncoprotein in various types of glomerulonephritis and renal allografts. Nephrol Dial Transplant, 1996; 11:997
5，Uda S,Yoshimura A, Sugenoya Y et al.Mesangial proliferative nephritis in man is associated with increased expression of the cell survival factor, Bcl-2. Am J Nephrol, 1998; 18:291
6，Sugiyama H, Kashihara N, Onbe T et al. Bcl-2 expression and apoptosis in nephrotoxic nephritis. Exp Nephrol, 1997; 5:481
7，王莎燕，戴 勇，黄瑞芳et al. 维持性血液透析患者血清sFas/Apo-1的变化及意义. 肾脏病与透析肾移植杂志，1998；7(6)：341
8，Sano H, Asano K, Minatoguchi S et al. Plasma soluble fas and souble fas ligand in chronic glomerulonephritis. Nephron,1998; 80:153
9，Ortiz Arduan A,Danoff T M,kalluri R et al.Regulation of Fas and Fas ligand expression in cultured murine renal cells and in the kidney during endotoxemia.Am J Physiol,1996;271:1995
10，余志远，钱家麒，赵涵芳 et al.尿毒症非透析患者外周血单个核细胞IL-1β、TNF-α和IL-6基因表达的研究.中华肾脏病杂志，1997；13(5)：276
［收稿1999-04-14，修回2000-05-15］