点击显示 收起
鼠抗人B7-1分子功能性单克隆抗体的制备及生物学特性
中国免疫学杂志 2000年第11期第16卷 免疫学技术与方法
作者：邱玉华 季玉红 郭玲 周照华 王月丹 傅晋翔 张学光
单位：苏州医学院生物技术研究所，苏州215007
关键词: B7-1；协同刺激分子；单克隆抗体；恶性淋巴瘤
摘 要 目的：制备鼠抗人B7-1分子的功能性单克隆抗体，研究其对 高表达相应配基分子细胞的生物学效应。方法：用两株转人B7-1基因细胞株XG7-B7和L-B7分别作为免疫原及 检测细胞株，利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体。以快速定性试纸分析法鉴定单抗 所属的小鼠IgG亚类，采用竞争抑制及间接免疫荧光法分析单抗的特异性和亲和力，以高表 达B7-1分子的恶性淋巴瘤细胞Raji和Daudi为靶细胞，分析单抗对其生长的影响。以人多发 性骨髓瘤细胞转入B7-1基因细胞株XG1-B7为刺激细胞，以人外周血单个核细胞(PBLs)为反 应细胞，用MTT法分析单抗的中和活性。结果：成功地获得了1株鼠抗人B7-1的功能性单克隆抗体(克隆4E5) ， 属于小鼠IgG1亚类，经流式细胞仪分析，4E5与PBLs、体外人工诱导的树突状细胞(DCs)、Ra ji和Daudi的阳性结合率分别为10.2%、95.1%、92.7%及89.2%；能完全阻断标准抗人B7 -1单抗与相应抗原的结合。同时还发现，单抗4E5能显著地抑制恶性淋巴瘤细胞Raji和Daud i的生长繁殖，并能阻断B7分子介导的协同刺激信号的传导。结论：单克隆抗体4E5是一株抗人B7-1分子的功能性单抗，具有重要的 研究和应用价值。
中国图书分类号 R392.11
Preparation of functional monoclonal antibody against h uman CD80(B7-1) and analysis of its biological effects
QIU Yu-Hua,JI Yu-Hong,GUO Ling et al.
(Institute for Immunology ,Suzhou Medical College,Suzhou 215007)
Abstract Objective:To obtain a monoclonal antibody(mAb) a g ainst human CD80(B7-1) and to study of its biological effects.Method s:The hybridoma cell line was obtained by using the B lymphoma hybrid oma technique after immun ization of Balb/c mice with XG7-B7 the cells.Ascites were induced to produce th e mAb.The specificity and affinity of mAb were verified B7 competition and FACS. Expression of B7-1 in PBLs,DCs,Raji and Daudi were studied by indirect immunofl uorescence.Using counting and trypan blue staining,inhibitory effects of mAb on R aji and Daudi cells were analyzed.The neutralization activity of the 4E 5 determined by MTT assay using PBLs as response cells.Results:The anti-CD80(B7-1) was obtained.The expression of B7-1 in PBLs、DC、Raji ad Daudi was 10.2%，95.1%，96.7% and 89.2%,respec tived 4E5 can inhibit the growth in Raji and Daudi cells and block the costimula tory signals of B7/CD28.Conclusion:4E5 is a specific and functional anti-CD80(B7 -1) and has high affinity for its ligand.It may be of significant value in basi c studies and find clinical applications.
Key words CD80(B7-1) Costimulatory molecule Monoclon al antibody Malignant lymphoma
B7是激发有效的细胞免疫反应所必需的协同刺激分子。B7家族包括3个成员 ，即B7-1(CD80)、B7-2(CD86)和B7-3。其中对B7-1的研究最多，该分子为约50 kD的跨 膜 糖蛋白，基因定位于3q21，属免疫球蛋白超家族(IGSF)的成员之一。B7与CD28/CTLA-4的结 合对免疫应答起着重要的调节作用［1，2］。一般认为CD28作为协同刺激分子的受体 ，通过与APC上B7分子的结合，起着传递信号、增强或放大免疫反应的作用，而CTLA-4在调 控T细胞反应的起始和终止方面起重要作用。正常生理状态 下，B7家族的 成员在功能上既分 工又合作，协调地控制着免疫应 答的进行。而在一些病理状态下，这种协调性可发生改变［3］。最近的研究表明，B7家族协同刺激分子及其受体的异常表达在某些疾病尤其 是自身免疫性及过敏性疾病的发生、发展中起一定作用［4］。本文报道一株鼠抗人B 7-1功能性单克隆抗体的制备及其生物学特性，尤其是对恶性淋巴瘤细胞Raji和Daudi的生 长抑制作用及对B7分子介导的协同刺激信号阻断作用的初步研究结果。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 1640和DMEM培养基(Gibco美国)，HAT、HT选择培养基(Si g ma美国)，PEG(Boehringe德国)，G418(Gibco美国)，标准抗人B7-1单克隆抗体(Immunotech 法国)，Protein G(Pharmacia瑞典)，小鼠IgG亚类快速定性试纸(Argen法国)。
1.2 细胞株及培养方法 XG7-B7和XG1-B7为人多发性骨髓瘤细胞转人B7 -1基因细胞株(本室建立)，XG1为人多发性骨髓瘤细胞(本室建立)，L-B7为小鼠成纤维细 胞转人B7-1基因细胞株(本室建立)，Raji和Daudi为人恶性淋巴瘤细胞株(ATCC美国)。这 些细胞株均 采用含10%FCS的1640培养基培养，其中转基因细胞的培养基中添加抗性筛选药物G418，以保 持目的基因产物的稳定表达。
1.3 分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤建株 将生长良好的XG7-B7细胞注 入小鼠的背部皮下及腹腔(1×107/只)。间隔3 w重复免疫，第2次免疫后10 d左右眼框取 血测定血清效价。于加强免疫后3～4 d取脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0混合(5∶1)，以5 0% 的PEG溶液(分子量1 500)为融合剂进行杂交，用含1%HAT、20%FCS的DMEM培养。以L-B7为检 测细胞株，用间接免疫荧光法对杂交瘤细胞的培养上清进行筛选，阳性孔细胞用有限稀释法 进行单克隆化培养，直至抗体分泌阳性率为100%。选择生长良好的杂交瘤细胞克隆(4E5)扩 大培养并及时液氮冻存。
1.4 4E5的生产及纯化 腹水型单抗的生产按本室建立的方法进行［ 5］，单抗的纯化采用Protein G亲和层析法：将腹水加入CaCl2、Sulfate dextran溶液 ，搅拌后静置0.5 h，离心(12 000 r/min，20 min)去除纤维蛋白。上Protein G亲和层析 柱， 甘氨酸洗脱，收集蛋白峰流出液，及时用pH 8.0的Tris溶液矫正pH至7.0，对PBS透析后 用 751紫外分光光度计测定抗体蛋白的含量，其浓度的计算公式为：抗体蛋白(mg/ml)=OD 280×1.55-OD260×0.76。
1.5 4E5的亚类鉴定 将快速定性试纸条轻轻插入含有约0.2 ml杂交瘤细 胞培养上清的小塑料管中，几分钟后试纸上出现与某一亚类名称相对应的蛋白条带， 此即该抗体所属的小鼠IgG亚类。
1.6 4E5的效价鉴定 以XG7-B7为检测细胞，将杂交瘤细胞的培养上清、 腹水和纯化后的抗体蛋白梯度稀释后与之结合。用间接免疫荧光法分析，以出现同样阳性率 及荧光强度时的最大稀释倍数为抗体的效价。
1.7 4E5的特异性鉴定 采用竞争抑制分析法，将XG7-B7细胞(5×105/ 管)，用PBS洗涤后加入4E5抗体(每管10 μg/50 μl)，4℃作用45 min，洗涤后加入标准 C D80-PE直标单抗(每管2 μg/50 μl)，作用后用流式细胞仪分析。同时设置阴、阳性对 照。
1.8 4E5对DCs的识别 收集按本室方法［6］诱导的DCs(5×105/ 管)，加入4E5单抗与之结合，洗涤后加入羊抗鼠荧光二抗。用流式分析仪分析。
1.9 4E5对PBLs、Raji和Daudi的识别 将人PBLs单独及分别与Raji和Daud i细胞1∶1混合后分于小试管中(5×105/管)，加入4E5单抗及羊抗鼠荧光二抗，用流式细 胞仪分析。
1.10 4E5对恶性淋巴瘤细胞Raji和Daudi的生长抑制作用 将Raji(1×105 ml-1)和Daudi(2×105 ml-1)培养于24孔板中，加入4E5单克隆抗 体，使其终浓度分 别为1.0、2.5、5.0、10.0及20.0 μg/ml。在培养的24、 48、72、96 h时间点，分别计数细胞浓度。
1.11 4E5的中和活性分析 将丝裂霉素处理后的XG1-B7细胞(1×105 ml-1)与人PBLs(1×106 ml-1)等体积(各100 μl)混合于96孔板中，加入4E 5单抗，使其 终浓度为20 μg/ml，培养72 h，每孔加入20 μl 5%MTT溶液，继续培养4～6 h，测定OD 570，同时设置无关单抗及刺激细胞的对照实验组。
2 结果
2.1 特异分泌抗人B7-1单克隆抗体的杂交瘤建株 先后共融合12块96孔 板 ，克隆的平均生长率为71%，检测率90%以上。初次筛选共有9孔为分泌抗体阳性孔，复测后 获取1株持续分泌特异抗体的杂交瘤株(克隆4E5)。经体外连续传代培养，液氮冻存半年以 上，复苏后生长良好，分泌抗体的性能稳定。
2.2 4E5的生产和纯化 采用本室建立的腹水诱生方法生产单克隆抗体， 腹水形成的阳性率为80%，腹水的产量平均为7.9 ml/只小鼠。经Protein G亲和层析纯化后 ，抗体蛋白的含量平均为2.18 mg/ml腹水。
2.3 4E5的亚类及效价 快速定性试纸分析法的结果显示，4E5在标准试 纸的IgG1处出现蛋白条带，表明单抗4E5属小鼠IgG1亚类。经免疫荧光法分析表明4 E5腹 水型单抗的效价为1∶1 000以上，纯化后抗体蛋白用于间接免疫荧光分析的用量为1 μg/ 5×105细胞。
2.4 4E5的特异性 竞争抑制试验的结果(见图1)，4E5能完全阻断标准抗 人B7-1单抗与抗原的反应。表明该单抗是B7-1的特异性抗体，且与标准抗体识别相同或相 似的抗原位点。
2.5 4E5对DCs的识别 图2所示，4E5与体外人工诱导DCs的阳性结合率为9 5.1%。
2.6 4E5对PBLs、Raji和Daudi的识别 图3所示，4E5与人PBLs、Raji和Da udi的阳性结合率分别为10.2%、92.7%、89.2%。当Raji和Daudi分别以1∶1的比例掺入人 PBLs后，4E5抗体的阳性标记率分别为45.1%和42.9%。
2.7 4E5对Raji和Daudi细胞生长的抑制作用 图4所示，当4E5的浓度为2 .5 μg/ml时，即出现明显的生长抑制作用。
2.8 4E5的中和活性 图5所示，4E5能阻断B7-1分子介导的协同刺激信号 的传导，从而抑制XG1-B7刺激PBLs增殖的作用。
图1 4E5与标准抗B7-1 mAb(104)的竞争抑制试验
Fig.1 Competitive test of 4E5 with anti-B7-1(104) on XG7-B7 cells
Note:GAM-FITC.goat-anti-mouse-FITC
图2 4E5对细胞因子诱导的树突状细胞B7-1的识别
Fig.2 Recognition of the 4E5 to B7-1 of induced DCs with cytokines
Note:A.mAb 4E5;B.positive control mAb
图3 4E5对PBMC，Raji和Daudi细胞B7分子的识别
Fig.3 Recognition of the 4E5 to B7-1 of PBLs,Raji,and Daudi
Note:A.PBLs;B.Raji;C.Mixed Raji and PBLs;D.Daudi;E.Mixed Daudi and PBLs
图4 4E5对Raji和Daudi的生长抑制作用
Fig.4 Inhibition of 4E5 on Raji and Daudi proliferation
图5 4E5的中和活性分析
Fig.5 The neutralization activity of the 4E53 讨论
XG7-B7和L-B7分别为人多发性骨髓瘤细胞及小鼠纤维母细胞转人B7-1基因细胞株，二者 均高效表达膜B7-1分子。但考虑到XG7-B7细胞的异源性比较高，故将其作为免疫原，而把 L-B7作为检测细胞株，以增加目的抗体筛选的特异性。与蛋白质抗原相比，细胞的免疫原 性较强且抗原分子的空间构型能以自然的状态暴露于细胞膜表面，以更有效地激发机体的免 疫应答。
在单克隆抗体的生产上，我室对常规的腹水诱生方法给予了改进。即在初次致敏后7～10 d 注射杂交瘤细胞的同时，再次腹腔注射Pristane与福氏不完全佐剂等体积的混合物0.2 ml/ 只。这样可以持续刺激小鼠合成和分泌IL-6等细胞因子，提供良好的杂交瘤细胞生长微环 境。实验证明用这种方法诱导小鼠，腹水形成的速度加快，一般5～7 d即可见小鼠的腹部隆 起。腹水形成的阳性率达80%以上，腹水的收获量平均在8.0 ml/只左右。个别小鼠可 高达30.0 ml/只以上。而常规的诱生方法，腹水形成率一般在30%左右，腹水的收获量平均 少于5.0 ml/只，经对腹水的效价及纯化后抗体蛋白的含量测定表明，腹水产量增加的同时 ，抗体蛋白的含量及效价均未下降。
对抗体的特异性及亲和力鉴定，本文采用XG7-B7及人工诱导的DCs为靶细胞，竞争抑制实验 的结果表明，抗体4E5能完全阻断标准B7-1单抗与XG7-B7的结合；经间接免疫荧光法分析 ，4E5与DCs的阳性结合率为95.1%。提示4E5具有很高的特异性和亲和力。以XG1-B7为刺激 细胞，人PBLs为反应细胞，经MTT法分析表明，单抗4E5能阻断B7-1分子介导的协同刺激信 号的传导。从而抑制了淋巴细胞的增殖反应。这在器官移植的排斥反应和自身免疫性疾病等 的防治中可能具有积极的作用。最近的一些研究也表明：由B7∶CD28/CTLA-4介导的协同刺 激信号与某些疾病的发生、发展有关［8，9］。用特异性抗体封闭B7-1分子。可使 实验动物免患自身免疫性脑脊髓炎和过敏性哮喘等疾病。Takada M等的研究认 为，适当阻断B7介导的协同刺激信号，有助于移植器官的血液灌通，提高移植存活率，减少 因缺血造成的器官损伤等［10］。这些均提示抗B7单克隆抗体的研制有着重要的理论 研究和临床应用价值。
为进一步探讨4E5的生物学特性，我们又以高表达B7-1分子的恶性淋巴瘤细胞Raji和Daudi 为研究对象，观察和分析了4E5对两种肿瘤细胞的识别和生长繁殖的影响。目前的研究认为 ，大多数肿瘤细胞不表达B7分子，Chaperot L等［7］报道某些恶性淋巴瘤细胞表 达 该分子，我们利用4E5及标准抗人B7-1单克隆抗体，经流式细胞仪分析证实，Raji和Daudi 细胞B7-1分子的阳性表达率分别为92.7%和89.2%，采用干扰法将人外周血单个核细胞分 别与Raji和Daudi以1∶1的比例混合后，再用4E5进行识别，其阳性结合率分别为45.2%和42 .6%，表明4E5对肿瘤细胞的识别能不受其它细胞存在的影响而准确地到达靶细胞并与相应 抗原特异性结合。提示4E5单抗在该类疾病的辅助诊断和治疗后残留肿瘤细胞的监控中具有 应用价值。同时我们将不同浓度的4E5加入到Raji和Daudi的培养体系中，观察4E5是否影响 肿瘤细胞的生长，培养24 h即可见Raji和Daudi聚集成团，细胞中出现黑颗粒，折 光性和立体感减弱。而阴性及无关单抗对照组的细胞生长良好。通过细胞计数证实4E5的浓 度为5.0 μg/ml时即出现对肿瘤细胞生长的抑制作用。而不表达B7-1分子的人多发性骨髓 瘤细胞U266则无此现象。提示该抗体可能具有一定的临床应用价值。值得进一步的探讨。
作者简介：邱玉华，女，博士生，副教授，主要从事肿瘤免疫研究；张学光，男，博士生导师，教授，主要从事血液、肿瘤免疫研究
参考文献
1，Eine J S,Macosko H D,Justice L et al. An inhibitor of CD2 8-CD80 interaction impairs CD28-mediated costimulation of human CD4 T cells.Cell Immun ol,1999;191(1):49
2，Boulougouris G,Mcleod J D,Patel Y I.Positive and negative regulation of human T cells activation mediation by the CD28/CDLA-4 ligation(CD80).J Immunol,1998 ；161(8):3919
3，Trentin L,Zambello R,Sancetta R et al.B lymphocytes from patients with ch ronic lymphoproliferative disorders are equipped with different costimulatory mo lecules.Cancer Research,1997;57(21):4940
4，Nakajima A,Azmuma M,Kodera S et al.Preferential dependence of autoantibod y production in murine lupus on CD86 costimulatory molecules.Eur J Immunol,1995; 25(11):3060
5，邱玉华，张学光，郭 玲et al.鼠抗人sIL-6R单克隆抗体的制备及sIL-6R检测 方法的建立.细胞与分子免疫学杂志，1997；13(4)：58
6，顾宗江，王月丹，邱玉华et al.Gp130分子在树突状细胞上的表达及意义.中国免疫 学杂志，1999；15(5)：196
7，Chaperot L,Plumas J,Jacob M C et al.Functional expression of CD80 and CD8 6 allows immunogenicity of malignant B cells from non-Hodgkin's lymphom a.Exp Hematol,1999;27(3):479
8，Gallon L,Chandraker A,Tsazadeh S et al.Differential effects of B7-1 bloc kade in the rat experimental autoimmune encephalomyelitis.J Immunol,1997;159(9): 4212
9，Daikh D I,Einck B K,Linsley P S et al.Long term inhibitor of murine lupus by brief simultaneous blockage of the B7/CD28 and CD40/gp39 costimulation pathw ay.J Immunol，1997；159(7):3104
10，Takada M,Chandraker A,Nadeau K C et al.The role of B7costimulatory pathw ay in experimental cold ischemia/reperfusion injury.J Clin invest,1997;100(5):11 99
［收稿1999-12-28 修回2000-03-29］