A蛋白亲和层析法纯化动物血清抗体的效果比较

A蛋白亲和层析法纯化动物血清抗体的效果比较

免疫学杂志 1999年第2期第15卷 技术与方法

作者：邓瑞春　张明伟　白云秀　汪劲松　黄 英　毛 宁

单位：军事医学科学院瑞得四环生物技术研究所 北京 100850

关键词：A蛋白；亲和层析柱；抗体

　　摘　要　比较Hitrap Protein-A Sepharose亲和层析系统，对不同动物血清或抗血清的纯化效率，提供抗体纯化提供依据。结果显示该方法简便快速，纯化的抗体纯度高，并能较好地保持免疫学活性。层析柱反复使用40多次，纯化效率不变。但Protein-A对不同动物血清的IgG吸附能力不同。提示，应根据动物品种，选择合适的纯化方法。

　　中图号 R371-33

COMPARISON OF IgG PURIFICATION FROM

　　DIFFERENT ANIMAL SERA BY HITRAP PROTEIN

　　A AFFINITY CHROMATO-GRAPHY

Deng Ruichun，Zhang Mingwei，Mao Ning

　　（Beijing Read ＆ Four-Ring Institute of Biotechnology，Beijing 100850）

　　Abstract　Several kinds of IgG from different animal sera or antisera were purified by Hitrap protein A affinity chromatography，and their purities were compared．The results show that Hitrap protein A affinity chromatography might be an easy and efficient way to purify IgG．The Hitrap gel still works well in adsorbing the IgG after a long time use．But there are some difference among the ability of absorption of IgG from different sera．

　　Key words　Protein A，Affinity chromatography，Antibody

　　抗体现已广泛应用于生命科学的许多领域，尤其在疾病的诊断治疗和基础研究中发挥了越来越重要的作用。因为含有抗体的血清中有许多杂蛋白等，一般都需要先将抗体分离纯化。本文在比较了辛酸法和离子交换凝胶过滤法的基础上，进一步对Protein-A Sepharose affinity Chromatography进行了比较研究，现将结果报告如下。

1　材料和方法

1.1　材料

　　正常鼠血清、正常豚鼠血清、正常人血清、羊抗鼠血清、驴抗兔血清、兔抗大肠杆菌DH5α血清均由本室自制；Hitrap Protein-A Sepharose affinity columns（Pharmacia瑞典）；过氧化物酶（简称HRP，RZ＝3 sigma USA）。

　　紫外分光光度计（BECKMAN DU-600）；电泳仪和电泳槽（北京六一仪器厂）；酶联免疫测定仪（BDSL Immunoskman 340型）；超滤器（MICON8010）；激光扫描仪（Pharmacia LKB Ultrosan）

　　1.2　方法

　　1.2.1　抗体纯化：将1ml的HiTrap Protein-A Sepharose affinity column固定在铁架台上。用至少6倍体积的去离子水或起始缓冲液，洗出保护剂溶液。然后用2倍柱床体积的起始缓冲液平衡柱子，测定洗出液与起始缓冲液pH相同时，用注射器将血清样品注入，同时收集流出液。用至少8倍体积的0.02mol／L，pH7．0的磷酸盐缓冲液洗脱杂蛋白，收集洗脱液。用至少6倍体积的0.1mol／L，pH3．0柠檬酸缓冲液洗脱吸附于柱上的IgG，同时收集样品。测定280nm和260nm吸光度。

　　1.2.2　抗体纯度鉴定^［1］

　　1.2.3　蛋白浓度测定^［2］：根据下列公式计算蛋白含量：mg／ml＝1．45×OD280nm－0．74×OD260nm

　　1.2.4 纯化样品的浓缩采用超滤法。

　　1.2.5　HRP标记IgG^［3］

　　1.2.6　双抗体夹心ELISA法^［4］

2　结果和讨论

2.1　纯度测定　按本文所报告的实验条件，分别收集PB洗脱部分和柠檬酸缓冲液洗脱部分。所得样品进行PAGE电泳，测定IgG纯度及抗体的回收量。结果见图1。

图 1　纯化各步洗脱样品PAGE图

　　Fig 1　PAGE

　　①～⑥PB buffer elution fraction from goat anti-mouse serum，mouse serum，donkey anti-rabbit serum，human serum，guineapig serum，rabbit anti-DH5 α serum respectivily；（1）～（6）citric acid buffer elution fraction from goat anti-mouse serum，mouse serum，donkey anti-rabbit serum，human serum，guineapig serum，rabbit anti-DH5 α serum respectivily

　　图2为HiTrap Protein-A Sepharose affinity column纯化兔抗大肠杆菌DH5α的柠檬酸缓冲液洗脱部分，经PAGE电泳后的激光扫描结果。

图 2　豚鼠血清的柠檬酸缓冲液洗脱部分的激光扫描结果

　　Fig 2　Effect of laser scanning PAGE citric acid buffer elution fraction of guineapig serum

　　表1列出了其它几种动物纯化效果。

表1　各步洗脱样品IgG的含量比

　　Tab 1　Ratios of IgG content of pB and citric acid elution fraction

Serum	PB buffer	Citric acid buffer 　　igG（％）
Guineapig serum	14．32	100
Human serum	25．06	100
Donkey anti-rabbit serum	36．87	100
Rabbit anti-DH5α serum	7．55	96．92
Mouse serum	30．74	94
Goat anti-mouse serum	42．49	88

　　从图1和表1可见：首先，PB洗脱部分，羊、小鼠、驴、人血清中仍有大部分IgG没能被回收，而豚鼠、兔的IgG含量却很少。说明，Protein-A对前几种动物的IgG吸附能力弱，使得部分IgG随PB洗脱掉，降低了IgG的回收率；而对后两种动物IgG回收效果较好。其次，从柠檬酸缓冲液洗脱部分，豚鼠、人、驴的IgG纯度均达到一条带，即含量均100％，小鼠、羊除γ球蛋白带以外，在白蛋白部位还有较浅的蛋白带。

　　图2例举的是用Protein-Asepharose affinity column纯化豚鼠血清的激光扫描结果，可见IgG纯度为100％。

　　上述结果显示，Protein-A对动物血清IgG具有特异吸附能力，而对血清其它成分吸附能力很弱。这种特性可能与Protein-A的结构有关，即：Protein-A有6个不同的区域，其中5个与IgG的Fc区有强的结合能力，所以它能特异吸附IgG。但是，Protein-A对不同动物血清IgG吸附能力不同。这一结果可能因为不同动物IgG的Fc区结构不同，从而造成Protein-A对不同动物血清IgG吸附能力不同的现象。

　　2.2　IgG的回收　表2为Protein-A亲和层析柱纯化不同动物血清IgG的回收量。从表2可见，正常人、豚鼠、兔抗DH5α血清IgG的回收量都较高，而羊抗鼠、正常小鼠、驴抗兔的血清IgG回收量则较低，这一结果与上述电泳结果一致。此结果与文献报道的结果也基本一致。只是小鼠的结果略有不同，即Hitrap affincity culunm说明书为不吸附，本实验结果则为弱吸附。用此亲和层析系统还对驴血清进行了纯化，结果显示，Protein-A对驴的IgG有中等强度的吸附。此结果，尚未见文献报道。

表2　Protein-A亲和层析柱纯化不同动物血清IgG的回收量

　　Tab 2　Recovery amount of IgG

Serum	Amount（ml）	Times	Mean recovery amount 　　of IgG（mg／ml）
Guineapig serum	1	4	7．44
Human serum	1	4	9．40
Donkey anti-rabbit serum	1	4	5．0
Rabbit anti-DH5α serum	1	16	8．97
Mouse serum	1	5	3．74
Goat anti-mouse serum	1	5	2．47

　　此外，IgG回收量与层析过程中上样量有关，通过对兔抗DH5α血清上样量进行比较，用1ml Hitrap protein A Sepharose亲和层析柱，上样量以1ml为宜。当上样量大于2ml时，IgG回收量与1ml上样时相差不大，这说明上样量过大时，可能超过了Protein-A对IgG的吸附限度，因而造成IgG的浪费。

　　2.3　Protein-A Sepharose使用次数测试及效果观察　我们使用1ml Protein-A Sepharose层析系统对各种不同动物血清共进行43次（44．5ml）的抗体纯化，抗体的纯化效率未见改变。以兔抗DH5α为例，在第3～13次时，抗体的平均回收率为每毫升血清9.0mg，到了第37～38次时，抗体的回收率为每毫升9．5ml。前后几次，抗体的纯度均达到电泳一条带的纯度。说明，该层析柱具有较好的稳定性，能耐受强酸的反复处理。这一特点，可以大大提高层析柱的使用效率，降低使用成本。

　　2.4　与辛酸法和离子交换凝胶过滤法比较　以前，我们曾报导过用辛酸法和离子交换凝胶过滤法纯化抗体的效果比较，现将3种方法纯化抗血清的某些特点总结于表3。从表3可见，亲和层析法纯化的抗体纯度高、时间短效率高、再生方法简单、抗体免疫活性好。所以是一种很有实用价值的纯化方法。

表3　3种纯化抗体方法比较

　　Tab 3　Comparison of three methods for purification of antibody

Methods	Purity	Time	Quantity	Regenration of gel
Caprylic acid method	＞95％	＞12h	A large	No
Ion-exchange sephadex chromatography	＜90％	＞96h	A small-medium	Complex
Protein A affinity chromatography	100％	＜5min	A small-medium	Simple

　　2.5　纯化抗体的初步应用　兔抗DH5α酶标抗体的应用：采用文献［3］的改良过碘酸钠氧化法，对上面纯化的兔抗DH5α抗体标记辣根过氧化物酶。4mgHRP与6mg兔抗DH5α结合，得2ml，共4．194mg的HRP-IgG。当包被兔抗DH52 IgG浓度为4μg／ml、DH52菌体蛋白浓度0．625ng／ml时，将此酶标抗体稀释4 000倍，测得A492nm为1.148。此结果进一步说明，用Protein-A Sepharose亲和层析柱纯化的抗体纯度高，并很好地保持了IgG的免疫活性，符合制备HRP标记抗体的标准。

　　2.6　结论　Hitrap Protein-A Sepharose柱纯化抗体，纯度高、效率好。反复使用数十次，抗体纯度和活性不受影响。该层析系统对不同动物血清IgG有不同的吸附能力。这方面的数据应进一步积累，以便为抗体纯化工作提供选择依据。我们对该方法的实验条件进行了摸索，首先，各阶段洗脱体积都应适当加大，比如，按说明书上方法，要求使用5个柱床体积PB洗脱杂蛋白，但我们用此体积时，A280仍大于0.1，并未将杂蛋白完全洗净，所以我们使用的是8个柱床体积PB来洗脱杂蛋白。对上样量测试结果显示，1ml hitrap Protein A Sepharose每次上样1ml较为适宜，超过2ml可造成IgG的损失。作者简介　第一作者：女，37岁，硕士，助理研究员

　　参考文献

　　1　萨母布鲁J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T.分子克隆实验指导.金冬雁，黎孟枫，等译.北京：科学出版社，1992

　　2　方福德，周 吕，丁 濂，等.现代医学实验技巧全书（下册）.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1995

　　3　李成文.现代免疫化学技术.上海：上海科学技术出版社，1992

　　4　汪濂主.现代医学实验方法.北京：科学出版社，1997

（1998-06-15收稿；1998-12-29修回）