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大鼠MHC-Ⅰ类基因cDNA的克隆
免疫学杂志 1999年第3期第15卷 基础免疫学
作者：夏仁品 沈文律 罗义刚
单位：夏仁品 罗义刚 华西医科大学附一院普外科 成都610041；沈文律 汕头大学医学院附二院 汕头515031
关键词：词 分子克隆；MHC-Ⅰ；逆转录聚合酶链反应
摘 要 采用逆转录PCR技术自SD大鼠脾细胞中克隆出全长1125个bp的编码主要组织相容性抗原Ⅰ类分子（MHC-Ⅰ）cDNA，经限制性内切酶图谱分析证实后，定向插入表达载体pBV220，并筛选出带有插入片断的阳性克隆，为研究在原核或真核表达系统中表达及其在抗原识别、免疫应答中的作用奠定了基础。
中图号 R392.11
MOLECULAR CLONING OF CLASS I GENES IN THE MAJOR HISTOCOMPATIBILITY COMPLEX OF RAT
Xia Renpin， Sheng Wenlu， Lo Yigang
（Department of General Surgery， First University Hospital， West China University of Medical Sciences， Chengdu 610041）
Abstract The total RNA was extracted from the Rat Spleen cells． According to the published sequence of Rat MHC-Ⅰ（rMHC-Ⅰ）， a couple of primers for rMHC-Ⅰ was designed and synthesized．Through reverse trans-cription and Polymerase chain reaction， obtained a specific band of rMHC-ⅠcDNA fragment from Rat spleen cells． The obtained fragment was inserted to pBV220 plasmid and transformed to E． coli DH5a． Restriction enzyme digestion and PCR identified it as Rat MHC-Ⅰ with the whole reading frame of 1125 base pairs．
Key words Molecular cloning， Rat MHC-Ⅰ， RT-PCR
主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex， MHC）分子通过与经加工后的抗原肽结合，形成MHC／抗原肽复合物，供T细胞受体（TCR）识别，在免疫应答和免疫调节中起着关键性的作用，是免疫细胞间沟通信息、相互协作的基础。为此，90年代初Cristina等［1］从大鼠cDNA文库中克隆到大鼠MHC-Ⅰ cDNA，引起广泛注意。为了进一步探讨其在免疫应答及免疫调节中的作用，我们通过逆转录PCR技术从大鼠脾细胞中也克隆获得了MHC-Ⅰ cDNA。
1 材料与方法
1.1 材料 E．coli DH5a和质粒pBV220为华西医科大学钩体研究室伍卫华教授惠赠。总RNA提取试剂盒（QIAGen公司），RT-PCR及PCR试剂盒（GibcoBRL），EcoR I，BamH I，Pru I，Ssp I，Pst I内切酶及DNA Marker（华美公司），RNA酶（Promega），低溶点琼脂糖（Sigma），T4连接酶（GibcoBRL）。
1.2 引物设计合成 根据Cristina发表的MHC-Ⅰ cDNA序列，设计跨跃整个阅读框的一对引物。上游引物：5′-TTGAATTCCAGATGGAGGCGATG-3′，含起始密码子、EcoR I识别位点及保护碱基。下游引物：5′-CTGGATCCTTCTTTCATGCTTTAC-3′，含终止密码子和BamH I酶切位点，由Cybersyn公司合成。
1.3 总RNA的提取 SD大鼠麻醉后摘取脾脏，以100mg脾组织用QIAGEN公司的总RNA提取系统提取总RNA。脾组织经细胞裂解液变性、碾磨及离心后，将上清液转移到特定的旋转柱子中，加冲洗液离心冲洗3次，再以DEPC处理的双蒸水收集总RNA。以OD260／OD280比值检测纯度（大于1．8）。变性凝胶电泳检测RNA的完整性。
1.4 反转录PCR 以脾组织总RNA为模板，加入MHC-Ⅰ基因的下游引物，采用GibcoBRL公司的反转录系统行反转录，合成MHC-Ⅰ cDNA第一链，反应体积为20μl。取5～10μl逆转录产物为底物，加上游引物，用PCR试剂盒进行扩增，反应体积为50μl，引物浓度为50pmol／L。反应条件：94°C 1min，58°C 1min，72°C 1min，35循环。低溶点琼脂糖凝胶电泳回收扩增片断。
1.5 cDNA克隆扩增 回收反转录PCR产物，经EcoR I和BamH I酶切后，与相应酶切的pBV220质粒DNA连接，转化感受态大肠杆菌DH5a，涂板培养。利用pBV220中LacZ基因插入失活显色反应［2］，筛选出插入有MHC-Ⅰ类基因片断的白色阳性菌落。挑取白色菌落，小量扩增。以碱裂解法提取质粒，酶切鉴定。
2 结果
2.1 MHC-Ⅰ cDNA的RT-PCR产物分析 将RT-PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，可见一清晰的特异扩增带，其大小与理论预期（1．1kb）一致。
图 1 大鼠MHC-Ⅰ cDNA产物的凝胶电泳
Fig 1 Gel electrophoresis of RT-PCR product of
rMHC-Ⅰlane 1：λDNA／HindⅢ；lane 2：RT-PCR product of rMHC-Ⅰ
2．2 阳性克隆筛选 RT-PCR产物经双酶切与同样酶切的pBV220质粒连接后，转化大肠杆菌DH5a，挑取8个白色单菌落，按碱裂解法提取质粒DNA，经EcoR I， BamH I单酶和双酶切的酶切图谱如图2所示。
图 2 pBV／rMHC-Ⅰ重组体的酶切电泳
Fig 2 Restriction enzymes digestion of recombined
pBV／rMHC-Ⅰ
Lane 1：λDNA／Hind Ⅲ；Lane 2：pBV／EcoR I＋BamH I；
Lane 3：pBV／rMHC-I／EcoR I；Lane 4：pBV／rMHC-Ⅰ／BamH I；Lane 5：pBV／rMHC-I／EcoR I＋BamH I
2．3 rMHC-I类基因片断的酶切鉴定 从图3中可以看出，带有MHC-Ⅰ cDNA插入片断的阳性克隆可以被PstI酶切为2个片断，小片断为0．33kb。
图 3 pBV／rMHC-I质粒限制性酶切图谱
Fig 3 Restriction enzyme mapping of pBV／rMHC-I plasmid
Lane 1：λDNA／EcoR I＋Hind Ⅲ； Lane 2：pBV／rMHC-I／Ssp I；Lane 3：pBV／rMHC-I／Pru I；Lane 4：pBV／rMHC-I／Pst I
3 讨论
主要组织相容性复合体（MHC）是一组编码细胞表面某些抗原的连锁的基因群。在不同种属的哺乳类动物中，MHC编码的抗原系统有不同的命名，但它们在组成结构、分布和功能上都很相似。如在小鼠、大鼠、人类分别称为H-2、AgB或H-1，HLA抗原。MHC-I类分子含有2条分离的多肽链，一条是由MHC基因编码的α链，另一条为非MHC编码的β链，此类抗原广泛分布于体内多种有核细胞表面。MHC-I类分子将加工后的抗原递呈给CD8＋ T淋巴细胞，此路径的抗原加工与递呈由于其重要性近年来受到广泛重视。目前的研究认为，MHC-I类分子的a1和a2可变区外表面有一个20×10×10的沟槽，由8～9个氨基酸残基组成，这就是MHCI类分子的多肽结合部位［3］。MHC-I类分子限制性抗原的递呈是激活细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T lymphocyte，CTL）的前提，而CTL在机体抗瘤与抗病毒免疫中起重要作用。Nouri［4］等研究认为，I类抗原的表达下降是细胞由正常向异常转化的关键性环节之一，I类抗原分子表达的下降程度和肿瘤的恶性程度呈正相关。在小鼠和许多人类肿瘤及肿瘤衍生细胞系上均发现MHC-I类抗原表达的下降或缺失。若将I类抗原的基因转移给肿瘤细胞株，则后者的致癌性或转移性即降低或消失。
本研究应用分子生物学技术克隆MHC-IcDNA。根据文献报道合成一对可以克隆全长MHC-I cDNA的引物，且在两端添加了不同的酶切位点，便于质粒的定向克隆。用RT-PCR技术从大鼠脾细胞中成功克隆出全长为1．1kb cDNA。为进一步确定带有该插入片段的克隆为pBV-MHC-I，对其进行限制性酶谱分析：用EcoR I和BamH I双酶消化后，1％琼脂糖凝胶电泳可见两个DNA条带，与预计的大小一致；经Pst I（为MHC-I基因片断与pBV220上单酶切点）酶切后出现约0．33kb DNA，而经Ssp I及Pru I（均仅为pBV220上单酶切点）消化呈线性化。上述结果与理论预期一致,说明MHC-I已成功克隆到pBV220上。
MHC-I cDNA的获得，为进一步探索在原核或真核表达系统中表达，及其在抗原识别、免疫应答和免疫调节中的作用奠定了基础。
中国博士后科学基金资助项目
第一作者：男，31岁，博士后，主治医师（现在汕头大学医学院附二院外三科工作）
参考文献
1 Cristina Rada， Boberto Lorenzi， Simon J Powis， et al． Concerted evolution of class I genes in the major histo compatibility complexs of murine rodents． Proc Natl Acad Sci USA，1990，87：2167
2 Sambrook J， Fritsch EF，Maniatis T．Molecular Cloning——A Laboratory Mannual． 2nd． New York： Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1989
3 Sayegh MH，Watschinger B，Carpenter CB，et al． Mechanisms of T cell recognition of alloantigen——The role of Peptides． Transplantation， 1994，57：1295
4 Nouri AME， Dos Santos AVL， Crosbyo D， et al． Correlation between class I antigen expression and the ability to generate tumor infiltrating lymphocytes from bladder tumor biopsies． Br J Cancer， 1991， 64：996
（1998-03-02收稿；1998-07-13修回）