中国人MBL cDNA的克隆与序列分析 1

中国人MBL cDNA的克隆与序列分析¹

免疫学杂志 1999年第2期第15卷 基础免疫学

作者：陈政良　朱锡华　谢佩蓉

单位：第三军医大学免疫学教研室 重庆 400038

关键词：甘露聚糖结合凝集素　RT-PCR　cDNA克隆　序列分析

摘　要　从中国汉族人胎肝组织提取总RNA，以RT-PCR方法获取了编码含信号顺序的全长甘露聚糖结合凝集素（MBL）肽链的cDNA片段，将其与pGEM-T载体连接，转化大肠杆菌TG1，建立了MBL的cDNA克隆。序列分析表明：与文献报道的人MBL cDNA序列比较，差异颇大，但与GenBank中的人MBL mRNA比较，仅2个位置的核苷酸不同；其编码产物是20个残基的信号顺序和228个残基的成熟MBL多肽。

　　中图号 R392．13

CLONING AND SEQUENCING OF MANNAN-BINDING

　　LECTIN cDNA OF CHINESE

Chen Zhengliang， Zhu Xihua， Xie Peirong

（Department of Immunology， The Third Military Medical

　　University， Chongqing 400038）

　　Abstract　The intact cDNA encoding the mannan-binding lectin polypeptide including the signal sequence was isolated by using RT-PCR method with total RNA extracted from fresh liver tissue of a Han nationality foetus， linked into pGEM-T vector and transformed into E．coli TG1．The result of sequencing indicated that the sequence of our cDNA is different greatly from that of the reported human MBL cDNA but identical with that of the mRNA for human MBL in GenBank except two nucleotides，and that its encoded product consists of a typical hydrophobic signal sequence of 20 amino acids and a mature MBL polypeptide of 228 amino acids．

　　Key words　Mannan-binding lectin， RT-PCR， cDNA cloning， DNA sequencing

　　甘露聚糖结合凝集素（mannan-binding lectin， MBL）系C型凝集素超级家族中胶原凝素家族成员之一^［1］，可选择性识别甘露聚糖、N-乙酰甘露糖胺、N-乙酰葡糖胺和甘露糖等^［2］，并证实它能与多种细菌、病毒、真菌、寄生虫等结合，通过激活补体、调理吞噬而发挥天然抗感染免疫效应^［3］。白种人MBL基因已经克隆^［4，5］，而中国人该基因的结构尚未见报道。根据分子进化论的观点，中国人MBL基因的结构可能与白种人有异，而且为了深入研究MBL的结构与功能以及MBL缺损的分子机制，本文以RT-PCR法首次克隆了中国汉族人的MBL cDNA，并进行了序列分析。

1　材料与方法

1.1　主要材料　新鲜的5月龄汉族胎儿肝组织由南方医院妇产科提供；总RNA提取试剂盒系Pharmacia Biotech公司产品；AMV逆转录酶、dNTP、Taq DNA多聚酶购自Boehringer Mannheim公司；RNasin购自Sangon公司；限制性内切酶EcoR I、Hind Ⅲ、Pst I和λDNA／EcoR I＋HindⅢ marker购自华美生物工程；100bp DNA ladder购自Gibcol BRL；pGEM-T载体购自Promega公司；焦磷酸二乙酯（DEPC）为Sigma公司产品。

　　1.2　总RNA提取　取约100mg新鲜胎肝组织，按试剂盒说明书操作，提取总RNA。总RNA沉淀溶于100μl DEPC处理水中，－20°C保存。以1.5％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳和A260／A280值来判定RNA的质量和浓度。

　　1.3　引物设计与合成　根据文献报道的人MBL cDNA序列^［4］，经微机分析，设计并合成2个引物。引物1系MBL信号肽N端上游一部分序列并引入了1个EcoR I酶切位点，序列为：GCGAATTCCACACCAAGGGAGACCATGTCC；引物2是MBL肽链C端下游一部分序列的互补序列，引入了1个Hind Ⅲ酶切位点，序列是：GCAAGCTTACTCACAGACCCTTCAGATAG。

　　1.4　RT-PCR　逆转录反应：模板总RNA 1．5μg，AMV逆转录酶2．5u，适量特异引物和dNTP，总体积20μl，42°C水浴60min。PCR：取2μl逆转录产物为模板进行PCR，反应参数为：94°C变性40s，52°C退火50s，72°C延伸80s，共35个循环；最后72°C延伸7min。1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定RT-PCR产物。

　　1.5　分子克隆　质粒抽提、DNA酶切、电泳鉴定、回收、连接反应、细菌转化等均参照文献^［6］，略加修改进行。

　　1.6　DNA序列分析　采用PE310型DNA自动测序仪，进行双脱氧末端终止法自动荧光测序，以DNASIS软件进行核苷酸和氨基酸序列比较分析。

2　结果与讨论

2.1　人胎肝总RNA提取　提取制备的总RNA较纯，A260／A280值为1.9；经1.5％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，清晰可见18s和28s rRNA带，表明RNA无明显降解，此RNA制剂可直接用于RT-PCR。

　　2.2　RT-PCR获取人MBL全长编码区cDNA片段　以胎肝组织总RNA为模板，用1对特异引物进行RT-PCR。取5μl扩增产物经琼脂糖凝胶电泳观察，显示1条790bp左右的DNA条带（见图1），与预期的789bp一致。在第一次扩增出约790bp特异片段后，以1∶50稀释此扩增液，取5μl作为模板，即可有效地进行再次PCR，制备欲克隆片段。

图1　电泳分析RT-PCR扩增的人MBL cDNA

　　Fig 1　Electrophoresis of RT-PCR amplified human MBL cDNA

　　1：λDNA／EcoR I＋Hind Ⅲ marker

　　2：RT-PCR amplified human MBL cDNA

　　2.3　人MBL cDNA克隆与鉴定　将欲克隆的cDNA片段和pGEM-T载体直接连接，转化大肠杆菌TG1，涂平板后培养过夜，挑出阳性重组子菌落小量扩增，快速抽提质粒进行鉴定，结果见图2。首先以阳性重组子质粒为模板进行PCR扩增，获得约790bp的DNA片段。继用EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ双酶切阳性重组子后以1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定，除切下约3000bp的载体片段外，还有一约790bp的插入片段，它与PCR产物及欲克隆的cDNA长度相符，表明所克隆的人MBL cDNA是完整的。pGEM-T载体中外源基因插入位点是在55bp处，其73bp处有一个Pst Ⅰ酶切位点，文献报道的MBL cDNA^［4］95bp和500bp处各有一个Pst Ⅰ酶切位点。因此又用Pst Ⅰ酶切重组质粒，琼脂糖凝胶电泳出现约3000bp、400bp和300bp3条带，与预期结果一致，而且证实cDNA片段是正向插入的。经此系统鉴定，初步确定一个克隆为本实验所期望的cDNA克隆，命名为pGEM-mb1。

图2　重组质粒的鉴定

　　Fig 2　Identification of the recombinant plasmid

1：100bp DNA ladder

　　2：pGEM-mb1／Pst I

　　3：pGEM-mb1／EcoR I＋HindⅢ

　　4：Product of PCR of pGEM-mb1

　　5：λDNA／EcoR I＋HindⅢ marker2.4　人MBL cDNA序列分析　对以PCR扩增和酶切鉴定初步确认的阳性克隆pGEM-mb1进行全序列自动测试。由于此cDNA用于自动测序显得较长，为了保证测序结果的准确性，采用双向测序，两端的序列可互相校正。测序结果及其导出的氨基酸顺序见图3。

图3　pGEM-mb1编码区的核苷酸顺序、导出的氨基酸顺序及其与

　　人MBL mRNA和cDNA克隆^［4］的比较

　　Fig 3　Nucleotide sequence of pGEM-mb1 encoding region， its deduced amino acid sequence and comparison of the encoding regions among pGEM-mb1， mRNA and reported cDNA clone^［4］

　　（A）：pGEM-mb1 deduced amino acid sequence； （B）：pGEM-mb1； （C）：mRNA in GenBank； （D）：reported cDNA clone^［4］；——：signal sequence；---：homologous sequences；X：absent nucleotides in the cDNA clone^［4］；↓：domain／domain boundaries

　　pGEM-mb1的编码区（包括终止密码子）长747bp，编码1条248个氨基酸残基的肽链。典型的疏水性信号顺序20个残基，成熟MBL肽链228个残基，包括21个残基的N末端区（含3个Cys）、59个残基的Gly-X-Y重复顺序胶原样区（19个Gly-X-Y重复和第7、8位Gly-X-Y之间的Gly-Gln）、24个残基的颈区和124个残基的C末端糖识别域。

　　将pGEM-mb1的测序结果与文献［4］报道的cDNA序列比较，后者的信号顺序编码区有3处单碱基缺失，N末端区见1个碱基替换，胶原样区有单碱基替换、插入和缺失各1处，颈区有单碱基替换2个、插入和缺失各1处，糖识别域有碱基替换5个、单碱基插入和缺失各3处。但与1995年进入GenBank的人MBL mRNA（Accession X15422）比较，除了2个位置的核苷酸不同外，其余序列完全一致。证明我们克隆到的MBL cDNA与白种人的MBL基因是同一个分子，而文献^［4］所载MBL cDNA是不正确的，由于缺失和插入所致移码，导出的氨基酸顺序与本文的大相径庭，但各功能区的基本框架不变。 pGEM-mb1与GenBank中MBL mRNA的2处不同是：第24位密码由ACC变为GCC，编码产物的改变是Thr→Ala；第185位密码由GGC变为GGT，但编码产物未变，都是Gly。Thr为极性氨基酸，而Ala是非极性的。这一差异的意义如何，有待后续工作去考察。

　　MBL是天然免疫系统中的关键分子^［7］，而且MBL结构基因点突变的频率极高，可导致血清MBL水平低下，引起调理吞噬缺损，表现为各种病原体的反复急慢性感染，严重者可致命^［8］。最近报道MBL缺损者对HIV的易感性增高，患AIDS后存活期明显缩短^［9］，进一步佐证了MBL的重要性。然而，MBL的结构-功能关系以及MBL结构基因点突变致调理吞噬缺损的机制尚未明了。中国人MBL cDNA的克隆成功，为制备重组的人MBL制剂进一步研究MBL的功能、通过缺失或定点突变探索MBL的结构-功能关系以及MBL结构基因点突变引起调理吞噬缺损的分子病理机制等奠定了基础。

　　*　全军重点实验室项目基金资助

　　作者简介　第一作者：男，41岁，博士，副教授，现在第一军医大学免疫学教研室工作，广州510515

　　参考文献

　　1　陈政良.哺乳类C型凝集素超级家族.生物化学与生物物理进展，1997，24：491

　　2　陈政良，韩强涛，易正山，等.人血浆MBL的分离纯化及其特性鉴定.免疫学杂志，1998，14：12

　　3　陈政良，谢佩蓉.甘露聚糖结合蛋白.国外医学免疫学分册，1997，20：16

　　4　Ezekowitz RAB，Day LE，Herman GA．A human mannose-binding protein is an acute-phase reactant that shares sequence homology with other vertebrate lectins．J Exp Med，1988，167：1034

　　5　Taylor ME，Brickell PM，Craig PK，et al．Structure and evolutionary orgin of the gene encoding a human serum mannose-binding protein． Biochem J，1989，262：763

　　6　Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T．Molecular Cloning—A Laboratory Manual．2nd ed．New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1989

　　7　Thompson．Protein to proves to be a key link in innate immunity．Science，1995，269：301

　　8　陈政良.甘露聚糖结合蛋白基因突变引起的免疫缺陷.生命的化学，1997，17（4）：46

　　9　Garred P，Madsen HO，Balslev H，et al．Susceptibility to HIV infection and progression of AIDS in relation to vaiant alleles of mannose-binding lectin．Lancet，1997，349：236

（1998-12-29收稿）