抗哇巴因抗体及抗前海葱苷原A抗体的制备及其应用

抗哇巴因抗体及抗前海葱苷原A抗体的制备及其应用

免疫学杂志 1999年第4期第15卷 技术与方法

作者：李素琴 符云峰 卢振敏 朱树森 Wilhelm Schoner Christian Eim

单位：李素琴 符云峰 卢振敏 朱树森（ 河北省医学科学院实验医学研究所生化研究室 石家庄050021）；Wilhelm Schoner Christian Eim（德国吉森大学生化与内分泌研究所 GIESSEN 35392）

关键词：抗哇巴因抗体 抗前海葱苷原A抗体 钠泵抑制因子 高血压

　　摘 要 为了探索内源性钠泵抑制因子在高血压发生中的作用，利用家兔免疫制备了抗哇巴因抗体及抗前海葱苷原A抗体，并对其特性进行了鉴定。利用该两种抗体和ELISA法检测了高血压病人血浆及牛血清中哇巴因样及前海葱苷原A样钠泵抑制因子水平。检测结果发现原发性高血压病人血浆中存在哇巴因样物质水平（0．132±0.021mol／L）和前海葱苷原A样物质水平（0．102±DF8．8nmol／L）；牛血清中哇巴因样物质的水平（1．6±0．27nmol／L）明显高于前海葱苷原A样物质水平（0．222±0．086nmol／L）。证明内源性钠泵抑制因子哇巴因样及前海葱苷原A样物质在哺乳类动物血液里循环存在，是两种新的强心苷类固醇激素。

　　中图号 R335.4 R57

　　RAISED ANTIBODIES AGAINST THE OUABAIN AND

　　PROSCI-LLARIDIN A IN RABBITS

　　AND ITS APPLICATION

Li Suqin， Fu Yunfeng， Lu Zhenmin， Zhu Shusen， Wilhelm Schoner， Christian Eim

　　（Department of Biochemistry， Institute of Experimental Medicine， Hebei Academy of Medical Sciences， Shijiazhuang 050021）

　　Abstract To know the concentration of the isomer of ouabain substance and proscillaridin A-like substance how correlate with hypertension， we raised antibodies against ouabain and proscillaridin A and tested its concentration in the plasma of patients with essential hypertension and bovine serum with an indirect enzyme-linked immunosorbent assay． The results show that in human plasma exist ouabain-like substance （0．132±0．021nmol／L）and proscillaridin A-like substance （0．102±DF8．8nmol／L），and that in bovine serum the higher concentration of ouabain immunoreactivities （1．6±0．27nmol／L） than proscillaridin A immunoreactivities （0．222±0．086nmol／L）． We concluded that both concentration of the ouabain immunoreactive and proscillaridin A immunoreactive materials circulating in blood correlates with the blood pressure in essential hypertension．

　　Key words Ouabain antibody， Proscillaridin A antibody， Sodium pump inhibitor， Hypertension

　　80年代初国外学者报道在哺乳类动物体内存在一种内源性类洋地黄物质（Endogenous digitalis-like factor， EDLF），与地高辛抗体呈免疫反应，具有抑制细胞膜Na^＋ -K^＋ -ATP酶（钠泵）活性的作用，故称其为“钠泵抑制因子”，与血压和心功能调节有关。90年代初Hamlyn及其同事证明高血压病人血浆中的EDLF是一种哇巴因样物质^［1］，Haupert等证明牛下丘脑EDLF为哇巴因同分异构体^［2］。另有学者从心衰病人血浆中提取纯化得到海蟾蜍毒素（Marinobufagenin）^［3］，从高血压病人血浆中检测到前海葱苷原A样物质（Proscillaridin A-like subs-tance），与血压升高相关^［4］。为了进一步探索这两类物质是否同时在哺乳类动物体内存在，本文利用家兔免疫制备了抗哇巴因抗体及抗前海葱苷原A抗体，并对其进行了鉴定，用ELISA法利用该两种抗体检测了高血压病人血浆和牛血清中哇巴因样及前海葱苷原A样物质水平，现将结果报告如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂及仪器 哇巴因，前海葱苷原A，Freund′s完全佐剂等购自美国Sigma公司；HPLC（日本HITACH公司）。

　　1.2 抗体制备

　　1.2.1 取定量的前海葱苷原A（或哇巴因）与牛血清白蛋白的联接物100 μg溶于0．5 ml生理盐水，和0．5 ml Freund′s完全佐剂混合，在新西兰大白兔的脊背皮内注射5～6个点，以后第2、3、6、12周再行如上注射。第40周自耳静脉取免疫的兔血，分离血清备用。

　　1.2.2 抗体的纯化：将含于1mol／L甘氨酸和0.5mol／L NaCl（pH8．9）溶液内的抗血清球蛋白移入蛋白质A HPLC层析柱中，用0．1mol／L 柠檬酸（pH3．0）洗脱免疫球蛋白IgG，以pH7．0洗脱液进行超过滤浓缩，－20°C贮存于含0.02％ NaN₃和50％甘油的Tris／NaCl缓冲液（50mmol／L Tris， 150mmol／L NaCl， pH7．8）内。

　　1.2.3 抗体的鉴定：用ELISA法分别进行上述两种抗体与标准物哇巴因及前海葱苷原A以及其它同类物质的反应试验。

　　1.3 Na^＋ -K^＋ -ATP酶抑制因子的纯化 同参考文献［6］。将定量的高血压病人血浆或牛血清用乙醇提取（1∶8，v／v），再以C18 HPLC反相色谱纯化。

　　1.4 生物活性鉴定 用ELISA法测定高血压病人血浆及牛血清中内源性钠泵抑制因子哇巴因样及前海葱苷原A样物质的免疫活性。

　　2 结果

　　2.1 抗前海葱苷原A抗体 免疫40周后的兔抗前海葱苷原A血清滴度的kd值为2×10^－9mol／L。抗前海葱苷原A抗体与前海葱苷原A发生免疫反应，而不与哇巴因及其它物质发生反应，结果见表1。

表1 利用家兔免疫制备的抗哇巴因抗体及抗前海葱苷原A抗体特异性的比较

　　Tab 1 Comparison of specificities of antibodies against ouabain and

　　proscillaridin A raised in rabbits

Substances	Anti-Ouabain IgG 　　from rabbit（％）	Anti-Proscillaridin A IgG 　　from rabbit（％）
Cardenolides
ouabain	100	0
k-strophanthidin	16．67	0．083
digitoxigenin	3．95	N．D．
digitoxin	0	0．46
digoxigenin	0．23	N．D．
digixigeninsulfate	10	N．D．
digoxigenin-3-glucuronid	13．13	N．D．
digoxin	0．19	0
gitoxin	0．36	0．047
convallatoxin	200	0．054
Bufadienolides
proscillaridin A	7．75	100．0
bufalin	N．D．	84．4
marinobufagenin	N．D．	5．0
Other steroid hormones
cortisol	N．D．	0
estradiol	0	0
testosterone	N．D．	0．1
progesterone	N．D．	0．125
corticosterone	N．D．	0
aldosterone	0	0

　　n．D．：none detected2．2 利用抗哇巴因抗体和抗前海葱苷原A抗体和ELISA法测定高血压病人和牛血清中内源性钠泵抑制因子所采用的标准曲线 见图1。

图 1哇巴因和前海葱苷原A标准曲线

　　Fig 1The concentration-dependence of ouabain and proscillaridin A standard curve

　　2．3 高血压病人血浆和牛血清中哇巴因样物质和前海葱苷原A样物质的水平 见表2。

表2 高血压病人血浆和牛血清中哇巴因样物质和前海葱苷原A样物质的水平

　　Tab 2 The levels of ouabain and proscillaridin A immunoreactivities in plasma of patients with essential hypertension and bovine serum （

Species	Ouabain 　　immunoreactivity 　　（noml／L）	Proscillaridin A 　　immunoreactivity 　　（noml／L）
Human	0．132±0．021（n＝42）	0．102±DF8．8（n＝18）
Bovine	1．600±0．27（n＝18）	0．222±0．086（n＝13）

　　dF：Geometric mean and dispersion factor

　　3 讨论

　　我们以往的研究证实，在高血压病人血浆中存在一种具有强力抑制Na^＋ -K^＋ -ATP酶活性的哇巴因样内源性钠泵抑制因子，其水平高于正常人^［5］；也证实在哺乳类动物体内同时存在哇巴因样和前海葱苷原A样两种钠泵抑制因子，尤以肾上腺和下丘脑最为丰富^［6］。本研究证据表明，在高血压病人血浆和牛血清中同时存在两种钠泵抑制因子哇巴因样和前海葱苷原A样物质，前者浓度高于后者。该免疫制备物抗哇巴因抗体与哇巴因发生免疫反应，而与前海葱苷原A不发生免疫反应；抗前海葱苷原A抗体与前海葱苷原A发生免疫反应，而与哇巴因几乎不发生交叉反应，表明该两种内源性钠泵抑制因子在哺乳类动物体内同时独立存在，并可能与高血压的发生和发展有关。这两种抑制因子的生物合成部位和化学特性，以及在高血压发病中的病理生理作用机制还在进一步研究中。

　　第一作者：李素琴，女，43岁，大学，研究员

　　参考文献

　　1 Hamlyn JM． Discovery of endogenous ouabain：A new mammalian hormone． In： bamberg E， Schoner W． eds． The Sodium Pump． New York： Steinkopff-Darmstadt， Springer，1994．722

　　2 Haupert GTJr． Endogenous “Digitalis ”， physiological and structural characterization of a ouabain isomer isolated from bovine hypothalamus． Ther Res， 1995，16：51

　　3 Bagrov AY， Fedodorova OV， Austin-L JL， et al． Endogenous marinobufalin-like factor and Na^＋-K^＋-ATPase inhibition during voluntary hypoventilation． hypertenson， 1995，26：781

　　4 Sich B， Kirch U， Tepel M， et al． Pulse pressure correlates with a proscillaridin a immunoreactive compound． Hypertension， 1996，26：784

　　5 符云峰，李素琴，王 薇.原发性高血压病患者血浆中钠泵抑制因子水平升高的直接证据.心肺血管学报，1990，9（1）：17

　　6 Li Suqin， Christian Eim， Ulrike Kirch， et al． Bovine adrenals and hypothalamus are a major source of proscillaridin A and ouabain immunoreasctivities． Life Sciences，1998，62（11）：1023

（1998-12-02收稿；1999-04-19修回）