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IFNγ和IL-6或IL-1联合应用对人肝癌细胞系C1抑制物合成的作用
免疫学杂志 1999年第4期第15卷 基础免疫学
作者：陈晓韧 谢佩蓉 郑 萍
单位：第三军医大学免疫学教研室 重庆 400038
关键词：细胞因子 C1抑制物 肝癌细胞系
摘 要 为研究细胞因子联合作用时对人肝癌细胞系C1抑制物（C1INH）合成的影响，用ELISA双夹心法测定了经细胞因子联合作用后HepG2和SMMC7712细胞培养上清中C1INH的含量。结果表明：IFNγ分别与IL-6和IL-1共同作用时，能显著增加人肝癌细胞系C1INH的合成，其作用强于同剂量IFNγ的单独作用。IL-1本身不能增加HepG2细胞C1INH的合成。IL-1对IL-6的上调没有增强作用，也无抑制作用。
中图号 R392．11
EFFECT OF COMBINATIONS IFNγ WITH IL-6 OR IL-1
ON COMPLEMENT 1 INHIBITOR SYNTHESIS IN
HUMAN HEPATOMA CELLS
Chen Xiaoren，Xie Peirong，Zheng Ping
（Department of Immunology，The Third Military Medical
University，Chongqing 400038）
Abstract In order to study the effect of cytokine combinations on C1 inhibitor（C1INH）synthesis in human hepatoma cells，we used sandwich enzyme-linked immunosorbent assay to measure the concentration of C1INH in the supernatants stimulated by cytokine combinations．The results showed that IFNγ plus IL-6 or IL-1 could signi-ficantly stimulate C1INH synthesisa，which was more powerful than IFNγ alone．IL-1 did not significantly stimulate C1INH synthesis，and it had no effect on IL-6′s upregulation or downregeulation to the C1INH synthesis．
Key words Cytokine，C1 inhibitor，Hepatoma cells
C1INH作为一种主要的Ⅱ类补体急性时相蛋白（APP），其合成受多种炎性细胞因子的调控［1］。由于人体有一个复杂的调控体系，各因子都不是孤立起作用的，因此各细胞因子间存在相互影响。为了解它们共同存在的情况下对C1INH合成的影响，本文选取了人肝癌细胞系HepG2和7712细胞，研究了IFNγ、IL-6、IL-1联合作用对细胞C1INH合成的变化。现报道如下：
1 材料和方法
1.1 主要试剂 RPMI 1640培养基购自Gibco；新生小牛血清（NCS）购自本校检验系；rIL-6，rIL-1及rIFNγ购自北京邦定生物医学公司；C1INH标准品及兔抗人C1INH血清购自上海生物制品研究所；羊抗鼠IgG酶标抗体购自北京中山公司；C1INH单抗F7由本室制备及纯化［2］。
1.2 细胞系 人肝癌细胞系HepG2细胞（由中科院病毒所提供）和7712细胞（由重庆医科大学范维珂教授惠赠），分别培养于含10％灭活NCS的RPMI-1640培养液中，内含链霉素100μg／ml，青霉素100u／ml，L-谷氨酰胺2mmol。
1.3 细胞因子对肝癌细胞系C1INH合成的调节实验
1.3.1 细胞的制备：HepG2和7712细胞培养成单层细胞后，用0．25％的胰蛋白酶消化，同时加入0．02％的EDTA以分散细胞，经洗涤后用含10％NCS的RPMI-1640稀释成105个细胞／ml，分别加至96孔Linbro细胞培养板中，每孔200μl，置于37°C、5％CO2孵箱中培养。
1.3.2 刺激实验：上述细胞培养至第2d，镜下观察已长成单层细胞，此时即可吸出板中培养液，根据实验要求设计对照，并将各种细胞因子用培养液稀释成所需浓度，分别加入各孔中，每孔200μl。以此为0时相点，将培养板置于孵箱中继续培养，并分别于选定的各时相点收集培养上清，－20°C冻存备测。细胞培养上清中C1INH含量的测定及数据的统计学处理按文献［3］。
2 结果
2.1 IFNγ和IL-6的联合作用 HepG2，7712细胞铺板长成单层后，吸出原培养液，将同时有IFNγ和IL-6（各为50u／ml）的培养液加入培养板，以IFN γ（50u／ml）为对照，分别于第1、2、3、4d收集细胞培养上清，用ELISA双夹心法检测其C1INH含量。结果显示，IL-6能明显增强IFN γ的作用，其C1INH合成量大于同剂量IFN γ的单独作用（见图1、图2）。
图 1IFNγ和IL-6对HepG2细胞系C1INH合成的联合作用s值已标出。
Fig 1Effect of the combination IFNγ with IL-6 on C1INH synthesis in HepG2 cells
s values are presented．
图 2IFN γ和IL-6对7712细胞C1INH合成的联合作用s值已标出。
Fig 2Effect of the combination IFN γ with IL-6 on C1INH synthesis in 7712 cells
s values are presented．
2.2 IL-1及其与IL-6的联合作用 HepG2细胞铺板长成单层后，吸出原培养液，分别加入只含IL-1（100u／ml）或IL-6（100u／ml）和同时含有IL-1及IL-6（各为100u／ml）的培养液，对照则不含细胞因子，分别收集4d培养上清并检测C1INH的含量。可以发现，与对照相比，IL-1本身不能刺激HepG2细胞C1INH合成的显著增加，它与IL-6共同作用时，不具有增强作用，也未见其对IL-6作用的抑制，与IL-6（100u／ml）相比P＞0．05（见图3）。
图 3IL-1和IL-6对HepG2细胞系C1INH合成的联合作用s值已标出。
Fig 3Effect of the combination IL-1 with IL-6 on C1INH synthesis in HepG2 cells
s values are presented．
2.3 IFNγ和IL-1的联合作用 HepG2细胞铺板长成单层后，吸出原培养液，分别加入只含IFNγ（100u／ml）和IL-1（100u／ml）及同时有IFNγ和IL-1（各为100u／ml）的培养液，分别收集4d培养上清并检测C1INH的含量。结果表明：从第2d以后IL-1能明显增强IFN γ的作用，培养上清中C1INH分泌量大于同剂量IFN γ的作用，与IL-1的作用相比则有极显著差异（见图4）。
图 4IFN γ和IL-1对HepG2细胞C1INH合成的联合作用
s值和P值已标出：*P＜0．01；**P＜0．001与IL-1（100u／ml）相比。
Fig 4Effect of the combination IFN γ with IL-1 on C1INH synthesis in HepG2 cells
s and P values are presented．*P＜0．01；**P＜0．001compared with IL-1（100u／ml）．
3 讨论
细胞因子间的协同效应对C1INH合成的影响是一个非常有意义的话题。IFNγ不仅能调节IL-6的产生，还与后者有显著的协同效应。二者联合作用时，HepG2和7712细胞C1INH合成的增加量高于IFN γ的单独作用，此时若加入IL-6的抗体会影响IL-6的作用，但对IFN γ的刺激作用并无影响［4］。因此，C1INH的合成至少可通过两条途径加以诱导，一是通过IL-6，二是借助IFN γ。它们有各自不同的刺激效应，一种因子的效应在另一种因子的共同作用下可以发生显著变化。补体APP合成的诱导是参与急性时相反应的特异性细胞因子作用的结果，它反映了外来刺激和机体炎症反应的程度。
IL-1是一种单核因子，可由多种细胞合成和分泌。它与肝细胞上的Ⅰ型受体结合后，通过Ras-MAPK信号传导途径，诱导活化蛋白-1（AP-1），NF-κB和NF-IL6转录因子等，活化多种免疫分子的启动子，从而促进其基因表达［5］，它是急性时相反应时的主要介质之一。本实验表明，IL-1本身并不影响细胞C1INH的分泌。但是，它与IFN γ共同作用时，可以显著增加C1INH的合成，其C1INH的增加量大于同剂量IFN γ的单独作用。
C1INH是一种Ⅱ类APP，在IL-6类细胞因子刺激其合成增加时，再加入IL-1类细胞因子不会产生协同作用，有时甚至可能有抑制作用［5］。在急性时相期，IL-6可以部分介导IL-1的作用，二者的相互作用可通过两种途径实现：一是在产生过程中二者的交互作用；二是增加对方膜特异性受体的表达。不过，有关IL-1与IL-6共同作用时对C1INH合成的影响的结果报道却不尽相同：Bruce等于1990年报道IL-1对IL-6有明显的抑制作用，且与IL-1的加入时间有关［4］。Falus等人则于同年报道IL-1与低剂量IL-6（10u／ml）有明显的协同作用［6］；而在本实验中，IL-1（100u／ml）和IL-6（100u／ml）共同作用时，C1INH的合成量与同剂量IL-6单独作用时的效果较为接近，未见IL-1对其有明显抑制作用（P＞0.05）。产生这种现象的原因可能是多方面的，如各实验室使用的HepG2细胞系可能分属不同的克隆株，重组IL-1在生产、活性等方面也有所不同，检测方法及实验器材的差异等。因此，IL-6和IL-1共同作用时对C1INH合成的确切作用，其细胞学特性和分子机制都还有待进一步探讨。本文丰富了细胞因子对人肝细胞系C1INH合成调控的资料，并为深入研究奠定了基础。
第一作者：女，29岁，硕士（现在空军总医院检验科 北京100036）
参考文献
1 陈晓韧，谢佩蓉.细胞因子对补体急性时相蛋白C1INH合成调控机制的研究.国外医学·免疫学分册，1999，22（1）：21
2 谢佩蓉，郑 萍，姜 曼，等.抗人C1-INH单克隆抗体的制备及其在分离人血清中C1-INH的作用.免疫学杂志，1991，7（1）：22
3 陈晓韧，谢佩蓉，郑 萍，等.IFN γ对U937细胞C1抑制物合成调控作用的研究.免疫学杂志，1998，14（4）：250
4 Bruce L，Zuraw，Martin Lotz.Regulation of the hepatic synthesis of C1 inhibitor by the hepatocyte stimulating factors interleukin 6 and interferon γ．J Bio Chem，1990，265：12664
5 John E，Volanakis．Transcriptional regulation of complement genes．Ann Rev Immunol，1995，13：277
6 Falus A，Rokita H，Walcz E，et al．Hormonal regulation of complement biosynthesis in human cell lines-Ⅱ．Upregulation of the biosynthesis of complement components C3，factor B and C1 inhibitor by interleukin-6 and interleukin-1 in human hepatoma cell line．Mol Immunol 1990，27：197
（1999-05-17收稿；1999-08-31修回）