应用Protein G纯化细胞培养上清中的大鼠单抗

应用Protein G纯化细胞培养上清中的大鼠单抗

免疫学杂志 1999年第3期第15卷 技术与方法

作者：白 丽　Lindsay Dent

单位：：白 丽　大理医学院微生物学及免疫学教研室 大理 671000；Lindsay Dent　澳大利亚阿得雷德大学微生物学及免疫学系，Adelaide 5005

关键词：杂交瘤细胞株培养上清 大鼠单克隆抗体IgG 纯化 链球菌G蛋白 亲和层析

摘 要 用miniPerm系统旋转连续培养大鼠杂交瘤细胞株，获得大量含抗鼠IL-4（IgG1）和IL-5（IgG1和IgG2a）抗体的培养上清；经PM10膜超滤、50％饱和硫酸铵沉淀及链球菌G蛋白-琼脂糖亲和层析纯化IgG单抗。结果每升杂交瘤细胞培养上清得到大鼠IgG22～36mg；1次可纯化抗体达20mg；经SDS-PAGE及ELISA鉴定，所得到的抗体纯度高、活性保持良好。

　　中图号 R392-33

PURIFICATION OF RAT MCABS FROM CULTURE SUPERNATANTS BY PROTEIN G

Bai Li，Lindsay Dent

　　（Department of Microbiology ＆ Immunology，Dali Medical College，Dali 671000）

Abstract A simple，three-step procedure to purify the rat IgG monoclonal antibodies from the hybridoma cell culture supernatants is described．We got a lot of the cell culture supernatants that contain rat anti-mouse IL-4（IgG1） and IL-5（IgG1 and IgG2a）monoclonal antibodies by using miniPerm System to culture rat hybridoma cells．In the first step，the supernatants are ultrafiltered with PM10 membrane．In the second，IgG fractions are precipitated with 50％ of saturated ammonium sulfate．In the final，the monoclonal antibodies are purified by the high performance Protein G-Sepharose affinity column．The results show that we get IgG 22～36mg from 1 liter of the cell culture supernatants．The antibodies show a high purity and good activities monitored by SDS-PAGE and ELISA，respectively．About 20mg of antibody is obtained by only one purifying procedure．

　　Key words Hybridoma cell culture supernatant，Rat IgG monoclonal antibody，Purification，Streptococcus Protien G，Affinity chromatography

　　小鼠是当代医学研究中十分重要的实验动物，而单克隆抗体（McAbs）的应用则是目前所有研究中十分活跃和引人注目的领域。无论是单抗在标本检测研究中的应用，还是在预防或治疗研究中的应用，高纯度单抗的获得均是将单抗应用于各种研究的关键，因此，单抗的纯化研究目前仍在不断的改进中。在各种动物来源的单克隆抗体中，大鼠单克隆抗体的纯化尤为困难，但其在小鼠动物模型中的应用却十分广泛。本文采用超滤、硫酸铵沉淀及链球菌G蛋白（Protein G）亲和层析等系列步骤，成功地从多株大鼠抗小鼠杂交瘤细胞培养上清中纯化大鼠IgG类单克隆抗体，取得了良好的效果。

1 材料和方法

1.1 含单克隆抗体上清的制备 所用杂交瘤细胞系大鼠11B11和BVD6（产生抗小鼠IL-4抗体）、TRFK4 和TRFK5（产生抗小鼠IL-5抗体）系实验室（Department of Immunology ＆ Microbiology，University of Adelaide，Australia）保存细胞株，其单抗属IgG1或IgG2a亚类。杂交瘤细胞株经复苏后用含10％FCS（Cytosystem，Australia）的RPMI-1640（GIBCO，USA）培养液（含15mmol Hepes，100U／ml青霉素，100ug／ml链霉素，2mmol／L谷氨酰胺），在miniPerm（Heraeus，Gemeny）系统中旋转连续培养，至培养液变黄色后，收获培养液。

　　1.2 单克隆抗体的初步纯化 使用PM10膜（Amicon，Danvers，USA）超滤浓缩含McAb培养上清10～20倍。浓缩上清经50％饱和硫酸胺（SAS）沉淀，4°C条件下经15 000r／min离心，用PBS溶解沉淀物，溶解液置PBS透析24h，其间换液6次。

　　1.3 Protein G亲和层析纯化 按参考文献［1］进行，并作了部分改良，具体方法如下：

　　1.3.1 配制缓冲液：起始缓冲液为pH7．0 20mmol／L磷酸缓冲液；洗脱缓冲液为pH2．7 0.1mmol／L甘氨酸盐酸。

　　1.3.2 准备收集管：取1．5ml离心管，每支离心管加70μl pH9．0 1mol／L Tris-HCl。

　　1.3.3 样品准备：经50％ SAS沉淀得到的样品，置起始缓冲液进行透析过夜，并经0．22m微孔滤膜滤过。

　　1.3.4 纯化过程：用足够的起始缓冲液（8～10ml）平衡Protein G-琼脂糖亲和层析柱（HiTrap Protein G 1ml，Pharmacia Biotech）。取待纯化的样品（每毫升样品含蛋白10．2～21．1mg）15～25ml上柱，流速为0．5ml／min，然后以同样的流速依次用起始缓冲液7～8ml、洗脱缓冲液6～7ml、起始缓冲液5ml洗涤，每管1ml收集洗脱液，测每管OD₂₈₀吸收值。收集第2洗脱峰（见图1），BCA法（Sigma，USA）测蛋白含量，4°C保存备用。

　　1.4 纯度及活性鉴定 纯化的McAb用SDS-PAGE^［2］鉴定其纯度。用10％分离胶、5％浓缩胶，设标准分子量（94KD，67KD，43KD，20.1KD及14.4KD）（Pharmacia），恒流下电泳2h，考马斯亮蓝R250（Pharmacia）染色。纯化的McAb用双抗体夹心生物素-链霉亲和素ELISA法鉴定^［3，4］。

2 结果

2.1 抗体纯化 含大鼠抗小鼠IL-5和IL-4的杂交瘤细胞培养上清经超滤法去除绝大部分液体及分子量＜10KD的蛋白得到10～20倍浓缩的培养上清，后者经50％SAS沉淀后得到初提的大鼠IgG。最后用Protein G纯化，得到两个不同洗脱峰的曲线（见图1），第1峰为非结合峰（杂蛋白），第2峰即为所需的单克隆抗体峰，两峰间分离度良好。TRFK5细胞、11B11细胞和BVD6细胞产生的IgG1与TRFK4细胞产生的IgG2a纯化时得到的洗脱曲线类似。

图 1用Protein G纯化大鼠单克隆抗体IgG

　　Fig 1Purification of monoclonal rat IgG using HiTrap Protein G

　　2.2 抗体纯度 还原性SDS-PAGE结果显示，经上述纯化过程纯化后的大鼠IgG1或IgG2a纯度好（见图2），只出现清晰的免疫球蛋白重链和轻链两条带。

图 2纯化的大鼠单克隆IgG抗体的SDS-PAGE

　　Fig 2SDS-PAGE electrophoresis of purified monoclonal rat IgG

　　Line A：Rat hybridoma cell culture supernatant，reduced，diluted 1∶10

　　Line B：Purified monoclonal rat IgG，reduced

　　Line C：Molecular marker

　　2．3 抗体活性 经双抗体夹心ELISA法证明TRFK4、TRFK5、11B11和BVD6抗体均有良好活性，测定样品的敏感性分别为IL-4 1．25U／ml及IL-5 30pg／ml。

　　2.4 Protein G柱交联量和重复性 我们用同一类型Protein G柱纯化大鼠抗小鼠细胞因子抗体约20次，发现当样品上样量足够时，1ml Protein G柱可交联抗体超过20mg，故1次纯化即可得到高质量大量抗体。该方法的重复性极佳（P＜0．01）。

　　2.5 收获抗体量 TRFK4、TRFK5、11B11和BVD6杂交瘤细胞培养上清经上述系列方法纯化后，每升培养液可得到IgG分别为24～28mg、22～25mg、32～34mg和33．5～36mg。

　　3 讨论

　　大量的研究事实已经证明：亲和层析法纯化单抗是一种简单而有效的方法。过去常采用的是SPA亲和层析，但SPA对大鼠的各类Ig亲和力极低。本研究采用链球菌Protein G亲和层析纯化大鼠IgG1和IgG2a抗体，取得了良好的效果。Protein G为G组链球菌表面所具有的1种蛋白，它具有两个IgG结合位点，作为IgGFc受体能与IgGFc段结合，与SPA相比，能与更多种属的IgG结合，并对各种属IgG有更高的亲和性和更强的结合能力。除对大鼠IgG有高度亲和力外，对人各亚类IgG、兔、牛、马、山羊、绵羊、豚鼠、狗、猪、小鼠IgG均有很强的亲和力，故已被用于纯化多种McAb和各种多克隆IgG^［5，6］。应用基因工程制备的Protein G，去除了天然Protein G与白蛋白结合的部位，故具有更高的特异性^［1，7］。Protein G对pH的适应范围很广，可在pH2～10环境中保持良好活性。当pH7．0时，Protein G与IgG的结合最强，当pH为2．5～3．0时，IgG可被洗脱^［1］。Protein G与Ig的结合能力主要取决于Ig的来源，也受流速、样品中Ig浓度影响。本研究结果表明，每毫升Protein G-琼脂糖可结合超过20mg的大鼠IgG，上样量可达25ml，因此，采用本方法1次可纯化大量IgG。在纯化过程中应注意的是，经冷藏或冷冻后含单抗的样品，在上柱前须经0．22u滤膜过滤以去除不溶性聚合物，否则会影响纯度，还有可能损坏层析柱。为了延长Protein G柱的使用寿命，每次使用层析柱后，均应用足量的起始缓冲液充分洗涤，然后加入20％乙醇置4°C保存。综上所述，本文报道的纯化单克隆抗体的方法简单、稳定，重复性好，所需时间短；操作方便，不需特殊仪器；1次可处理大量样品，成本相对较低，抗体活性保存好，可作为大量制备大鼠IgG方法采用。

　　第一作者：女，40岁，医学硕士，副教授

　　参考文献

　　1 Pharmacia LKB Biotechnology．Affinity Chromatography：Principles and Methods．Sweden ：Pharmacia，1995：53～56

　　2 Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T．Molecular Cloning：a Laboratory Manual．2nd ed．USA：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989：880～887

　　3 Schumacher JH，OGarra A，Shrader B，et al．The cha-racterization of four monoclonal antibodies specific for mouse IL-5 and development of mouse and human IL-5 enzyme-linked immunosorbent．J Immunol，1988，141：1576

　　4 Frendscho MH，Brown JF，Iizawa Y，et al．Administration of anti-IL-4 monoclonal antibody 11B11 increases the resistance of mice to listeria monocytogenes infection．J Immunol，1992，148：3978

　　5 Guss B，Eliasson M，Olsson A，et al．Structure of the IgG-binding regions of streptococcal protein G．EMBO J，1986，5：1567

　　6 Akerstrom B，Brodin T，Reis K，et al．Protein G：a powerful tool for binding and detection of monoclonal and polyclonal antibodies．J Immunol，1985，135：2589

　　7 Nygrem PA，Eliasson M，Palmcrantz E，et al．Analysis and use of serum albuming binding domains of streptococcal protein G．J Mol Recog，1988，69

（1998-10-26收稿）