聚合牛血红蛋白抗原性的初步研究

聚合牛血红蛋白抗原性的初步研究

免疫学杂志 2000年第1期第16卷 基础免疫学

作者：陈琳　王鹤尧　卜凤荣

单位：陈琳（军事医学科学院野战输血研究所，北京 100850）； 王鹤尧（军事医学科学院野战输血研究所，北京 100850）； 卜凤荣（军事医学科学院野战输血研究所，北京 100850）

关键词：血红蛋白；抗原性；ELISA

　　摘　要：目的 研究乙醇醛聚合的牛血红蛋白的抗原性。方法 ①将聚合的牛血红蛋白按兔血量的10％和20％分别输入兔耳缘静脉，免疫多次，ELISA检测抗体。②将聚合的牛血红蛋白、人血红蛋白和兔血红蛋白分别与免疫佐剂混合，按常规免疫家兔，并以上述3种抗原分别包被不同的聚乙烯板，ELISA检测每一种抗原与3种抗体交叉反应滴度。结果 聚合牛血红蛋白和人血红蛋白均产生抗体，且有交叉反应。结论 这两种血红蛋白可能有同源性，存在相似的抗原决定簇。而兔血红蛋白免疫家兔后无抗体产生，即机体对自体蛋白有天然耐受性。

　　中图分类号：R392.33文献标识码：A

The initial study on antigenicity of

　　polymerized bovine hemoglobin

CHEN Lin　WANG He-yao　BU Feng-rong

　　（Institute of Transfusion， Academy of Military Medical Sciences， Beijing 100850， China）

　　Abstract：Objective To investigate the antigenicity of polymerized bovine hemoglobin．Methods Polymerized bovine hemoglobin solution was infused into the vein of rabbits in many times， while polymerized bovine hemoglobin， human hemoglobin and rabbit hemoglobin were mixed with freund adjuvant respectively and then immunilized the rabbits by general methods．Polystyrene microtitre plates were coated with various hemoglobin including polymerized bovine hemoglobin， human hemoglobin and rabbit hemoglobin． Titre of the antibodies were tested by ELISA．Results 1． No antibodies of polymerized bovine hemoglobin appeared in vein infusion． 2． Antibodies of polymerized bovine hemoglobin and human hemoglobin appeared after rabbits being immunized， moreover， there were the cross-reaction high level．Conclusion Polymerized bovine hemoglobin and human hemoglobin share most of the epitopes of antigen． Antibodies did not produce after rabbits being immunized by their hemoglobin．

　　Key words：polymerized bovine hemoglobin； antigenicity； ELISA▲

　　鉴于牛血红蛋白来源广泛，容易获得，粘度低，氧亲和性低且不受二磷酸甘油酸（2，3-DPG）调节，而受血浆中Cl^－调节等优点^［1］，有希望成为血液代用品。国外戊二醛聚合的牛血红蛋白已进入Ⅲ期临床实验^［2，3］。本实验室采用了乙醇醛聚合牛血红蛋白，对家兔静脉输注，ELISA测定有无抗体产生。同时加入福氏佐剂进行免疫，观察聚合牛血红蛋白与人血红蛋白的抗原性差异,为其进入临床研究提供初步的实验结果。

　　1　材料和方法

　　1.1　材料

　　乙醇醛聚合的牛血红蛋白：由本组制备；动物：家兔，雌性，2 500～3 500g，由军事医学科学院动物中心提供；福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂：GIBCO公司生产；明胶：Serva公司生产；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔酶标二抗：Promega公司生产；酶联板：Nunc生产；Σ960全自动酶标仪：北京贝斯特公司生产；微量振荡器：北京海淀电子医疗仪器厂；其他试剂均为国产分析纯。

　　1.2　方法

　　1.2.1　静脉输入免疫：秤取家兔重量，以100g体重约含7ml血量计算，经兔耳缘静脉分别输入兔血量的10％和20％的聚合牛血红蛋白，接种多次。

　　1.2.2　血红蛋白抗原与佐剂混合、免疫。

　　1.2.2.1　制备人血红蛋白和兔血红蛋白：采血并用肝素抗凝，离心收集红细胞；生理盐水洗涤，脱氧，CO饱和红细胞，加1／3体积的CH₂Cl₂，振荡，离心收上层水相；60°C温浴1h，离心去沉淀，用ABL520血气分析仪测定血红蛋白含量。

　　1.2.2.2　聚合牛血红蛋白、人血红蛋白和兔血红蛋白分别与福氏佐剂充分乳化，采用皮下多点、腹腔注射途径常规免疫家兔，剂量为18mg／只。

　　1.2.3　检测：采用间接ELISA方法。

　　2　结果

　　2.1　静脉输注的Poly Hb抗原性 静脉输入兔血量的10％和20％的聚合牛血红蛋白，ELISA检测抗体结果见表1。结果显示：与阴性对照相比，10％和20％组血清中抗体滴度均为阴性，即该聚合牛血红蛋白抗原性较弱或无抗原性。

表1　家兔血清抗体滴度

　　Tab1　The antibody titers of the serum of rabbit

Blank 　　control	Serum 　　dilution	Negative 　　control	10％ group 　　serum	10％group 　　P／N	20％ group 　　serum	20％ group 　　P／N
0．045	10－1	0．708	0．859	—	0．895	—
	10－2	0．309	0．517	—	0．560	—
	10－3	0．312	0．197	—	0．204	—
	10－4	0．097	0．101	—	0．114	—
	10－5	0．092	0．084	—	0．091	—
	10－6	0．101	0．080	—	0．089	—

　　2.2　几种抗体滴度的比较　聚合牛血红蛋白、人血红蛋白和兔血红蛋白与佐剂混合分别免疫家兔多次，用上述3种血红蛋白包被聚乙烯板，ELISA测定3种血红蛋白抗体滴度，结果示于表2、表3、表4。

表2　3种血红蛋白抗体与聚合牛血红蛋白交叉反应结果

　　Tab2　The cross-reactions of polymerized bovine hemo-globin with antibodies of three kinds of hemoglobin

Blank 　　control	Serum 　　dilution	Negative 　　control	Bovine 　　Hb OD	Bovine 　　Hb P／N	Human 　　Hb OD	Human 　　Hb P／N	Rabbit 　　Hb OD	Rabbit 　　Hb P／N
0．039	10－1	0．825					0．922	－
	10－2	0．649	2．412	＋	2．704	＋	0．491	－
	10－3	0．136	2．268	＋	1．707	＋	0．156	－
	10－4	0．081	1．306	＋	0．874	＋	0．065	－
	10－5	0．060	0．734	＋	0．499	＋	0．061	－
	10－6	0．066	0．268	＋	0．140	－	0．062	－
	10－7	0．059	0．083	＋	0．071	－	0．066	－
	10－8	0．060	0．067	－	0．065	－	0．059	－

　　由表2可知：聚合牛血红蛋白和人血红蛋白抗体均与聚合牛血红蛋白反应，提示聚合牛血红蛋白与人血红蛋白有相似的抗原决定簇。兔血红蛋白抗体反应为阴性。

表3　3种血红蛋白抗体与人血红蛋白交叉反应结果

　　Tab3　 The cross-reactions of human hemoglobin with antibodies of three kinds of hemoglobin

Blank 　　control	Serum 　　dilution	Negative 　　control	Bovine 　　Hb OD	Bovine 　　Hb P／N	Human 　　Hb OD	Human 　　Hb P／N	Rabbit 　　Hb OD	Rabbit 　　Hb P／N
0．039	10－1	0．620					0．645	－
	10－2	0．265	2．542	＋	2．339	＋	0．446	－
	10－3	0．139	2．149	＋	1．870	＋	0．150	－
	10－4	0．060	1．168	＋	0．777	＋	0．061	－
	10－5	0．056	0．637	＋	0．373	＋	0．058	－
	10－6	0．056	0．177	＋	0．102	＋	0．055	－
	10－7	0．060	0．069	－	0．060	－	0．057	－
	10－8	0．058	0．060	－	0．064	－	0．063	－

　　由表3可知：聚合牛血红蛋白和人血红蛋白抗体均能与人血红蛋白反应，暗示聚合牛血红蛋白与人血红蛋白抗原性近似。兔血红蛋白抗体反应为阴性。

表4　3种血红蛋白抗体与兔血红蛋白交叉反应结果

　　Tab4　The corss-reactions of rabbit hemoglobin with antibodies of three kinds of hemoglobin

Blank 　　control	Serum 　　dilution	Negative 　　control	Bovine 　　Hb OD	Bovine 　　Hb P／N	Human 　　Hb OD	Human 　　Hb P／N	Rabbit 　　Hb OD	Rabbit 　　Hb P／N
0．039	10－1	0．613	0．456	－	0．562	－	0．541	－
	10－2	0．260	0．178	－	0．256	－	0．207	－
	10－3	0．104	0．080	－	0．098	－	0．087	－
	10－4	0．065	0．057	－	0．063	－	0．061	－

　　由表4可知：兔血红蛋白免疫家兔不产生抗体。聚合牛血红蛋白、人血红蛋白抗体均不与兔血红蛋白发生交叉反应。提示：聚合牛血红蛋白和人血红蛋白与兔血红蛋白抗原性不同或相似的抗原决定簇较少。3　讨论

　　乙醇醛聚合的牛血红蛋白对人有无抗原性是其作为血液代用品安全应用的重要方面。我们将聚合牛血红蛋白多次输注兔耳缘静脉，测定有无抗体产生。并通过在抗原中加入福氏佐剂免疫家兔，增强弱抗原的免疫原性，使兔产生抗该种抗原的抗体，通过观察聚合牛血红蛋白与人血红蛋白、兔血红蛋白抗原性的差异,间接了解其对人的抗原性。

　　按兔血量的10％和20％静脉多次输入聚合牛血红蛋白未检测到抗体，提示该聚合牛血红蛋白无抗原性或抗原性弱。而将牛、人、兔3种血红蛋白分别与佐剂混合通过皮下、腹腔兔疫家兔，产生兔抗牛血红蛋白抗体和兔抗人血红蛋白抗体，且存在抗原抗体交叉反应，可能由于聚合牛血红蛋白和人血红蛋白有相似的抗原决定簇，即这两种蛋白质抗原决定簇有同源性，该结果可利用计算机进行蛋白质空间结构模拟进一步证实。这两个实验结果为聚合牛血红蛋白用于临床提供了初步实验依据。兔血红蛋白不与上述两种抗体反应可能是兔血红蛋白与聚合牛血红蛋白和人血红蛋白抗原决定簇不同所致。用兔血红蛋白免疫家兔无抗体产生，这是机体对自体蛋白产生天然的免疫耐受。

　　作者简介：陈琳（1964-），女，四川人，实验师，本科，主要从事血液代用品的研究。

　　参考文献：

　　［1］HUGHES GS， ANTAL EJ， LOCKER PK， et al． Physiology and pharmacokinetics of a novel hemoglobin-based oxygen carrier in humans［J］． Crit Care Med， 1996，24（5）：756～764．

　　［2］WASCHKE KF， FRIETSCH TH， QUINTEL M， et al． Hemoglobin solutions［J］． Acta Anaesthesiol Scand Suppl， 1997，111：259～263．

　　［3］STEPHEN MC． The current status of hemoglobin-based blood substitues［J］． Ann Med， 1997，29：371～376．

收稿日期：1999-06-07

修回日期：1999-09-15