菌落PCR和质粒PCR对转化菌的筛选

菌落PCR和质粒PCR对转化菌的筛选

免疫学杂志 2000年第2期第16卷 技术与方法

作者：沈关心　朱慧芬　张 悦　王 硕　朱志刚　周 春

单位：同济医科大学免疫学教研室，湖北 武汉 430030

关键词：菌落PCR；质粒PCR；序列分析

　　摘　要：目的为建立简便、可靠转化菌的筛选方法。方法 应用菌落PCR和重组质粒PCR方法对转化菌进行筛选和DNA序列分析。克隆载体和表达载体筛选及鉴定采用与载体多克隆插入伍点序列互补的通用引物或免疫球蛋白家族特异性引物。阳性菌落和质粒PCR产物通过酶消化后作为模板进行自动测序。结果菌落PCR和质粒PCR技术可作为基因克隆筛选和鉴定的方法，结论菌落PCR和质粒PCR方法简便、快速、可靠，其产物可作为模板直接用于序列分析。

　　分类号：Q78；Q782；Q783　文献标识码：A

　　文章编号：1090-8861(2000)02-0151-03

Sereening of transfected bacteria by bacteria colonies PCR and plas-mid PCR

SHEN Guan-xin ,ZHU Hui-fen,ZHANG Yue ,WANG Shou ,ZHU Chun(Department of Immunology,Tongji Medical University ，Wuhan430030，China)

　　Abstract：Objective we have developed a procedure that allows rapid screening of transfected bacteria colonies and di-rect sequencing of bacteria colonies as well as plasmid pCR-products．Methods in the first step the multiple cloning sites con-taining the sequences of interest are amplified by bacteria colonies PCR and plasmid PCR using lacZ specific primers in cloned vectors．For screening of expression vectors of VH and VL of monoclonal antibodies we have used family specific primers．Colonies pCR-and plasmid PCR products are purified enzymaticaly and are used as templates in dye-primer or dye-terminator sequencing.Results The procedure allows fast sequencing of a large numbers of samples with minimal on-hands time and minimal need for precipitation/centrifugation steps．Using this method，we routinely can read 600 or more nucleotides for 120 PCR-products on a standard aBI 373A sequencer．Conclusions despite of the fact that our methods requires an additional PCR-step,its faster，cheaper and more reliable than the standard method using highly puuified plasmid DNA．

　　Keywords：bacteria colonies；PCR；plasmid pCR；sequences

　　PCR产物作为模型直接测序，具有快速、简便等优点。本研究采用与载体插入位点两端序列互补的通用引物(LacZfor和LacZback)，用克隆载体转染菌的筛选与鉴定。采用目的基因5'端和3'端特异性引物，用于表达载体转染菌的筛选和鉴定。并将9株抗不同抗原单克隆抗体可变区基因120个阳性质粒PCR和菌落PCR产物作为DNA测序模板，进行自动测序，现报道如下。1.2.1克隆载体的菌落或质粒PCR引物：由PerkinElmer公司合成。

　　 LacZback：5’-GCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGG-3‘；LacZfor：5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACG—3’。

　　 1.2．2表达载体的菌落或质粒PCR引物：鼠免疫球蛋白家族特异性引物[1～5]，由PerkinElmer公司合成。

　　 1.2．3测序引物：M13／pUC(-29)back：5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'；M13／pUC(-40)for:5‘-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’； 1.3质粒提取试剂QIAprepPlasmidMiniPrepKit购自Qiagen公司。

　　 1.4转化受体菌将目的基因转化JM109感受态细菌。

　　 1.5转化菌的筛选 1．5．1菌落PCR：用无菌牙签分别挑取单个白色菌落，浸泡在含20μl0.1%Triton液中置100℃加热2min。取2μl作模板，以LacZfor和LacZback为引物，进行PCR扩增。取10μlPCR产物，进行2%琼脂糖凝胶电泳，并在紫外光透射下进行凝胶照相。

　　 VH和VL表达载体转化菌的筛选和鉴定：同上法进行菌落处理，取2μl作模板，VH-pγ菌落PCR引物为特异性Vhback和Vhfor；VL-pκ菌落PCR引物为Vlback和Vlfor。

　　 1.5．2质粒PCR：采用QIAprepPlasmidMiniPrepKit进行小量质粒DNA的提取。取1μl质粒DNA作模板，进行PCR扩增和DNA凝胶电泳。

　　 1.6VH和VLDNA的序列测定取阳性菌落或重组质粒PCR产物作为模板，选用M13／pUC(-40)for或M13／pUC(-29)back作为测序引物，进行PCR扩增，采用PerkinElmer公司的ABIPRISMDyeTerminatorCycleSeqencingReadyReactionKit，在PerkinElmer公司的ABIPRISM373型自动测序仪上进行DNA序列测定[6]。

　　 2结果 2．1克隆载体转化菌的菌落PCR和质粒PCR采用一对与pGEM-T载体克隆位点两端序列互补的通用引物LacZfor和LncZback，通过菌落PCR或质粒PCR扩增。每份PCR产物取10μl进行2%琼脂糖凝胶电泳(见图1和图2)。若扩增出660～680bp大小片断(其中含pGEM-T载体序列250bp左右+VH序列430bp左右或VL序列410bp左右，包括前导序列)，即可认为VH或VL克隆至pGEM-T载体中。结果得到60个VH和60个VL阳性克隆。

　　 图1克隆载体转化菌落PCR产物琼脂糖电泳 Fig12%agarosegelelectrophoresisofcloningvector-transfectedbacteriacoloniesPCR-products LaneM：DNAmarker1～17；positive(+)18～24：negative(-)

　　 图2克隆载体质粒PCR产物琼脂糖电泳 Fig22%agarosegelelectrophoresisofcloningvector-transfectedbacterialplasmidPCR-products LaneM：DNAmarker；1，2，4，6，8，9，1O，12,14，18(+)

　　 Lane3，5，7，11，13，15，16，17．19，20．21(一)

　　 2．2表达载体菌落PCR和质粒PCR将经测序验证的VH和VL基因片断，分别与pγ和pκ载体连接，然后将VH-pγ连接子和VL-pκ连接子分别转化x-blue感受态细菌，采用鼠免疫球蛋白家族特异性引物，通过菌落PCR和质粒PCR扩增。经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。扩增片段约为336(VH)相315(VL)，即为阳性，见图3。结果得到10个VH和5个VL阳性表达载体。

　　 图3表达载体的质粒PCR(上)和菌落PCR(下)产物琼脂糖电泳 Fig32%agarosegelelectrophoresisofbacteriaco-loniesPCRandplasmidPCR-productsofexpressingvec

　　tor-transfectedbacteria LaneM；DNAAmarkerLane1,2．4，5，6，7(+)forplasmid-PCR LaneM：DNAmarker；Lane10,11,12，13，14(-)forbacte-riacoloniesPCR 2．3PCR扩增DNA的序列分析对120个克隆载体PCR产物进行序列分析，同一转化菌的菌落PCR和质粒PCR模板删序结果相符。

　　 3讨论 菌落PCR是以转化菌单个克隆为模板，采用特异性引物[7]或通用引物对目的基因进行扩增，用来鉴定和筛选阳性转化菌的技术。本研究采用与载体插入位点两端序列互补的通用引物，其扩增产物含目的基因和250bP左右的载体序列。用于克隆载体转染菌的筛选与鉴定。采用目的基因5'端和3'端特异性引物，用于表达载体转染菌的筛选和鉴定，可矿增出目的基因片断，并与cDNA片断直接比较，即可确定是否为阳性转化菌落。此外，也可直接从扩增菌中提取质粒DNA，并以此为模板进行质粒PCR。结果显示，若以质粒PCR阳性率(100%)为对照，不经Triton处理直接用单个细菌菌落进行PCR鉴定，阳性率约为60％。而挑取单个菌落经TritonX-100预处理后再进行PCR，则阳性率提高到100%。由此可见，菌落PCR技术作为基因克隆筛选和鉴定的方法，不必提取质粒DNA和酶切，简便快速可靠。LacZfor和LacZback是鉴定pGEM-T载体是否插入外源片断的通用引物。也可用于其它含有SP6和T7启动子的插入目的基因载体的扩增。

　　 本研究结果表明，将阳性质粒PCR和菌落PCR产物经ExoI消化及碱性磷酸酶处理后，作DNA测序模板，获得了非常好的效果，以质粒PCR产物作为模板效果尤佳。质粒PCR和菌落PCR产物作为DNA测序模板，需要量少,仅5μlPCR产物即可完成目的基因的DNA序列分析。具有经济、快速和测序结果满意等特点。

　　基金项目：国家自然科学基金资助项目(39370628)

　　作者简介：沈关心(1952-)，男,湖北安陆市人，教授,硕士，主要从事分子免疫学与肿瘤免疫学的研究。参考文献：

　　［1］ZHOU CHUN，SHAO JINFANG，WANG xIAOLIN.et al．cDNA sequence analysis of monoclonal antibo-dies against the human Plaacental acidic is oferritin[J]．Hybridoma．1998，17(3)：275．

　　［2］王 硕，沈关心，蒋琳，等．抗转铁蛋白受体单抗可变区基固克隆和序列分析[J]．细胞与分子免疫学杂志，1998，14(1)；13～19.

　　［3］朱志刚．抗CD4单抗可变区基因克隆和序列分析[J]．免疫学杂志，1999，15(2)：142.

　　［4］苏 娜，杨敬，王晓林，等．抗慢性淋巴细胞白血病独特到单抗SM6可变区基因序列分析[J]．中华血液学杂志，1998，19(7)：367～369．

　　［5］王 硕．沈关心．蒋 琳．等．功能性与非功能性IgVκ链序列分析[J]．中国免疫学杂志，1999．15(2)：82～85．

　　［6］沈关心，周汝麟，主编．现代免疫学实验技术[M]，湖北：湖北科技出版社．1998．438～443．

　　［7］TORUT,TAKUMI，HARVEY FL，Rapid cDNA cloning by PCR screening[J].Bio techniques．1994，17：443～445．

收稿日期：1999-02-03

修稿日期：1999-12-08