点击显示 收起
抗人IgG-抗HRP双特异性单克隆抗体细胞株的建立与鉴定
免疫学杂志 2000年第3期第16卷 技术与方法
作者：徐青 汪厚平 巫山 邓伟吾
单位：徐青（上海第二医科大学瑞金医院呼吸科，上海 200025）；邓伟吾（上海第二医科大学瑞金医院呼吸科，上海 200025）；汪厚平（上海第二医科大学第一附属医院，上海 200025）；巫山（卫生部武汉生物制品研究所，湖北 武汉 430045）
关键词：杂交-杂交瘤；人IgG；抗人IgG-抗HRP双特异性单克隆抗体
［摘 要］目的 制备人IgG检测用双特异性单克隆抗体诊断试剂。方法 用人IgG免疫BALB／c小鼠脾细胞与抗HRPMcAb杂交瘤细胞HAT敏感株进行第2次融合。结果 获得5株能稳定分泌抗人Ig-抗HRP的双特异性单克隆抗体的杂交-杂交瘤细胞，分泌的抗体亚类其中1株为IgG2a／IgG1，余为IgG1／IgG1。培养上清与腹水效价分别为2－7，10－5以上，经HRP亲和层析有2个蛋白吸收峰，BsMcAb存在于第2峰。用ELISA法及免疫印迹试验证明：BsMcAb只与人IgG有特异性反应。杂交-杂交瘤细胞连续3月培养和反复冻存，复苏后仍能稳定保持分泌BsMcAb的能力。结论 该方法制备简单，灵敏高度，具较好的应用前景。
［中图分类号］R371 ［文献标识码］A
［文章编号］1000-8861（2000）03-0225-04
The establishment and identification of cell line of anti-human IgG-anti HRP bispecific monoclonal antibody
XU Qing，DENG Wei-wu
(Department of Respiratory Deseases，Ruijin Hospital，the Second Medical University，Shanghai 200025，China)
WANG Hou-ping
(The First Hospital of the Second Medical University，Shanghai 200025，China)
WU Shan
(Wuhan Institute of Biological Products of Health Administration，Wuhan 430045，China)
［Abstract］Objective In order to prepare bispecific monoclonal antibody for detection of human IgG.Methods 8-azaguanine（8-AG） resistant hybridoma mutants keeping the ability of secreting anti HRPMcAb were used to fuse with spleen cells of BALB／c mice which had been immunized with human IgG.Results Five positive clones secreting anti-IgG-anti-HRP BsMcAb were obtained.The BsMcAb of one cell line was Ig2a／IgG1，the other were IgG1／IgG1 subclass.The titer of the supernatant and ascitics of the five hybrid-hybridomas cell lines were over 2－7 and 10－5 respectively.The BsMcAb were purfied by affinity chromatography.The second peak can be measured BsMcAb.The specifities of BsMcAb were analysed by ELISA and immunoblot，show that they can only react with human IgG.The number of hybrid-hybridomas chromosomes is more than the parental ones.After repeatedly frozen，thawed and passaged，the five hybrid-hybridomas were proved to be capable of secreting BsMcAb stably.Conclusion This method had higher sensitivity and simplicity.It can be used widely.
［Key words］hybrid-hybridoma；human IgG；anti-IgG-anti-HRP bispecific monoclonal antibody（BsMcAb）
双特异性单克隆抗体可同时与两种不同的抗原特异性结合，因此在免疫诊断和免疫治疗方面有着广泛的应用前景。我们采用杂交瘤技术，通过两次融合建立了杂交-杂交瘤细胞株［1］，旨在制备特异性高，操作简便的人IgG检测用的双特异性单克隆抗体的诊断试剂。
1 材料与方法
1.1 抗HRP细胞株HAT敏感株建立 将分泌抗HRP的杂交瘤细胞株（卫生部武汉生物制品所），经递增浓度8-AG驯化后，获得能耐受30μg／ml的8-AG的HAT敏感株，作为再次融合的亲本瘤细胞。
1.2 动物免疫与细胞融合 用静脉注射用丙种球蛋白，按常规方法免疫BALB／c小鼠，取免疫脾细胞与HRPMcAb细胞株HAT敏感株的细胞按2∶1的比例，用PEG9MW4 000作为融合剂，按常规方法进行融合，筛选，克隆化。
1.3 培养上清及腹水的BsMcAb的检测 用人IgG（购自Sigma公司）包被酶标板过夜，洗涤，封闭，加培养上清，孵育，洗涤加HRP，孵育后加底物，检测OD值。
1.4 细胞染色体计数 采用秋水仙碱终止分裂法，同时制作亲本瘤细胞和双杂交瘤细胞的染色体涂片。
1.5 抗体的类和亚类鉴定 采用免疫双扩散法。
1.6 BsMcAb的提纯 方法参见文献［2］。腹水经50％饱和硫酸铵盐析处理获得粗制品抗体，然后通过自制HRP-Sepharose4B亲和层析柱，先用0.01mol／L pH7.4的PBS洗脱出第1峰后，再用0.1mol／L pH3.5甘氨酸盐缓冲液洗脱出第2峰，并用0.1mol／L氢氧化钠中和洗脱物至pH7.4，检测各峰抗体活性。
1.7 抗体特异性检测
1.7.1 ELISA法检测BsMcAb与人IgG及无关抗原反应。
1.7.2 免疫印迹试验：方法参见文献［3］。将人IgG等经过SDS-PAGE电泳后转移至膜上，再进行免疫酶染色。
1.8 相对亲和力的检测 方法参见文献［4］。
1.9 杂交-杂交瘤细胞分泌稳定性观察。
2 结果
2.1 细胞融合 两次融合共接种576孔，有462孔克隆生长，融合率达80％，BsMcAb的阳性率12％，将强阳性孔经过3次克隆后获得5株能稳定分泌Bs-McAb的杂交-杂交瘤细胞，分别Bs208，Bs308，Bs321，Bs408，Bs452。
2.2 细胞染色体计数 杂交-杂交瘤细胞染色体平均数高于亲代瘤细胞的染色体数目，表明融合成功，但丢失较明显（见表1）。
表1 亲本瘤细胞与杂交杂交瘤细胞染色体计数（条）
Tab1 The numbers of chromosomes of the parental tumor cell and the hybrid-hybridomas
|
Cell |
Distribution of
chromosoes |
Average number |
| Parental tumor cell | 80～90 | 86 |
| Hybrid-hybridomas cell | 106～134 | 118 |
2.3 IgG类和亚类鉴定 1株为IgG2a／IgG1，其余4株为IgG1／IgG1（HRPMcAb为IgG1）。
2.4 培养上清及腹水效价 培养上清效价在2－7以上，腹水效价10－5以上与一般单克隆抗体效价相仿。
2.5 BsMcAb的提纯 经HRP-Sepharose4B层析柱后有两个蛋白吸收峰，第1峰为流穿峰，无Bs-McAb，第2峰有BsMcAb，推测为BsMcAb与单特异性抗体抗HRPMcAb的混合物。采用ELISA方法鉴定BsMcAb的效价，当浓度为10－5时，其OD值为阴性对照的2.1倍，由此得出BsMcAb的效价为10－5（见图1）。
图1 HRP-Sepharose4B亲和层析结果
Fig1 The result of HRP-Sepharose 4B affinity chromato-graphy
2.6 BsMcAb特异性鉴定 ELISA法检测5株杂交-杂交瘤分泌抗体与人IgG发生特异性反应，与无关抗原不发生交叉反应（见表2）。
表2 BsMcAb与人IgG及无关抗原的反应
Tab 2 The reactions between BsMcAb with human IgG and unrelated antigens
|
Covered antigen |
Hybrid-hybridomas cell line | ||||
| Covered antigen | Bs208 | Bs308 | Bs321 | Bs408 | Bs452 |
| Human thrombin | 0.08 | 0.073 | 0.12 | 0.09 | 0.035 |
| Human albumin | 0.058 | 0.14 | 0.13 | 0.12 | 0.048 |
| HbsAg | 0.066 | 0.11 | 0.068 | 0.05 | 0.06 |
| HbcAg | 0.08 | 0.12 | 0.07 | 0.12 | 0.06 |
| Human IgG | | | | | |
Suggest OD value is more than 2.5；The figures in the table are OD 290nm OD value. 免疫印迹试验亦同样证明BsMcAb均在人IgG相应位置出现单一的条带（见图2）。
图2 Western bloting实验结果
Fig 2 The result of westing-blotting
1～4 were stained by aminoblack.1：protein marker；
2：national standard；3：human plasma；4：human IgG；
5～14 were stained by immunoenzyme；5 and 6：respectively means
the enzyme-stained results of human plasma and human IgG by electrophoresis
transfer electrophoresis transfer with Bs208，Bs308，Bs321，Bs408 and Bs452；
12 and 13 respectively means the immunoenzyme-stained results of human IgG by
electrophoresis transfer with the supernatents of the BsMcAb of antiTh-antiHRP，
antiTNF-antiHRP；14：the immuno with HK
2.7 相对亲和力的测定 5株杂交-杂交瘤细胞分泌的BsMcAb的相对亲和力由强到弱依次为Bs408，Bs452，Bs208，Bs308，Bs321（见图3）。
图3 5株BsMcAb的剂量反应曲线
Fig3 The dose-response curve of the five positive clones
2.8 杂交-杂交瘤细胞分泌BsMcAb的稳定性 5株杂交-杂交瘤细胞连续3个月培养，反复冻存，复苏，仍能保持分泌BsMcAb，其效价未见明显下降，杂交杂交瘤细胞注射小鼠腹腔仍能产生高滴度的抗体。
3 讨论
双特异性单克隆抗体由于可同时与两种不同抗原结合，因此对免疫诊断有广泛的应用前景［5，6］。目前制备BsMcAb大都采用化学交联法和细胞融合法，化学交联会导致蛋白变性，失活，收量少，批间差异大，不易控制条件，因而这种方法受到限制。通过细胞融合得到杂交-杂交瘤细胞分泌BsMcAb可避免化学交联法的缺点，可从培养上清及腹水中源源不断获得大量的抗体。
杂交-杂交瘤细胞是多倍体细胞，染色体极易丢失，如果表达BsMcAb中任何一条Ig链染色体或基因丢失，细胞就丧失了分泌BsMcAb的能力，因此要获得杂交-杂交瘤细胞较困难［7］，克服的方法是进行大量的融合，及时筛选，多次克隆化，可弃去丧失分泌BsMcAb功能的细胞对具有分泌BsMcAb细胞的竞争性生长，可获得较稳定分泌BsMcAb的杂交-杂交瘤细胞。杂交-杂交瘤细胞所表达的2种不同的H链和L链组合可构成10种构型分子［8］。包括BsMcAb和2种亲本抗体，在检测中由于亲本抗体的竞争抑制的干扰，融合细胞进行筛选时可适当增加包被抗体的量，使亲本抗IgG和BsMcAb有足够的抗原结合位点，有效克服亲本抗IgGMcAb的干扰。
杂交瘤细胞分泌的抗体不仅含有所期待BsMcAb，尚有大量亲本细胞所分泌的单特异性抗体及其他无活性抗体成分。因此BsMcAb纯化很重要。由于不同特异性IgG，其分子量，轻，重链带电性质及荷电量都相差很小，故提纯困难［9，10］，本文用亲和层析去除单特异性IgGMcAb，所得的是BsMcAb与单特异性抗IgGMcAb与BsMcAb竞争结合血清标本中IgG，提高了检测的灵敏度，至于残存的在BsMcAb中单特异性抗体，可适当增加HRP的浓度而不致造成不良效果。
［作者简介］徐青（1965-），女，山东济宁市人，主治医师，博士，主要从事哮喘的免疫治疗研究。
［参考文献］
［1］MILSTEIN C，CUELLO AC.Hybrid hybridomas and their use in immunohistoch emistry［J］.Nature，1983，305：539～544.
［2］沈关心.现代免疫学实验技术［M］.湖北：湖北科学技术出版社，1998.36～38.
［3］沈关心.现代免疫学实验技术［M］.湖北：湖北科学技术出版社，1998.410～412.
［4］徐志凯.实用单克隆抗体技术［M］.陕西：陕西科学出版社，1993.
［5］SURESH MR，CUELLO AC.Advantages of bispeci-fic hybridomas in one-step immunocychemistry and immunoassays［J］. Proc Natl Acad Sci USA，1986，83：7984～7989.
［6］SONGSIVILAI S，LACHMANN PJ. Bispecific monoclonal antibodies from hybrid hybridomas［J］. Clin EXP Immunol，1990，79：315～320.
［7］KOOLWIJK P，ROZEMULLER E，STAD RK，et al.Enrichment and selection of hybrid hybridomas by percoll density gradient centrifugation and fluorescent-activated cell sorting［J］. Hybridoma，1988，7：217～224.
［8］SURESH MR，CUELLO AC，MILSTEIN C.Bispecific antibody：a tool for dianosis and treatment of di-sease［J］. Methods Enzyymol. 1986，121：210～217.
［9］POHL C，DENFELD R，RENNER C，et al. CD30-antigen-specific targeting and activation of T cells via murine bispecific monoclonal antibodies against CD3 and CD28：potential use for the treatment of Hodgkins lymphoma［J］. Int J Cancer，1993，54：820～824.
［10］INKEL JEJ.Immunotherapeutic potential of bispecific antibodies［J］. Immunology Today，1997，18：562～572.
［收稿日期］1999-02-26；［修回日期］1999-12-22