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Dot-ELISA法检测家蚕核型多角体病毒蛋白组份方法的建立及应用
免疫学杂志 2000年第3期第16卷 技术与方法
作者：李卫党 何家禄 许化溪 季平 李良菊 臧磊 刘恭植
单位：李卫党（镇江医学院免疫研究室，江苏 镇江 212001）；许化溪（镇江医学院免疫研究室，江苏 镇江 212001）；李良菊（镇江医学院免疫研究室，江苏 镇江 212001）；臧磊（镇江医学院免疫研究室，江苏 镇江 212001）；刘恭植（镇江医学院免疫研究室，江苏 镇江 212001）
关键词：dot-ELISA；家蚕核型多角体病毒蛋白组份；抗体
［摘 要］目的 建立家蚕核型多角体病毒蛋白的dot-ELISA检测方法。方法 免疫家兔制备抗蚕核型多角体病毒蛋白组份的多克隆抗体，并用ELISA间接法建立了检测方法。结果 此法与人血清和兔血清无交叉反应，可检测微量多角体病毒蛋白，其灵敏度达10ng，且操作简便。结论 本法可用于家蚕生物反应器生产的目的蛋白中多角体病毒蛋白组份的检测以及感染动物血清检测。
［中图分类号］R575.2 ［文献标识码］A
［文章编号］1000-8861（2000）03-0223-02
Establishment and use of a Dot-ELISA for determination of the protein component of bombyx mori nuclearpolyhedrosis virus
HE Jia-lu，XU Hua-xi
（The Seriucltural Research Institute of Chinese Academy of Agricultral Sciences，Zhenjing 212001，China）
LI Wei-dang，JI Ping，LI Liang-ju，ZANG Lei，LIU Gong-zhi
（Department of Immunology，Zhenjiang Medical College，Zhenjiang 212001，China）
［Abstract］Objective In order to establish an indirect type of dot-ELISA for the protein of Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus.Method Polyclonal antibody to the protein of Bm-NPV was produced by conventional immunization to rabbit，the assay was established according to indirect type of ELISA.Results No cross reaction was found with human serum and rabbit serum，the sensitivity of the immunoassay was 10ng.Conclusion This assay could be applied in detecting the leftover protein of the product that Bm-NPV gene expression system produced and the serum of infected mice.
［Key words］Dot-enzyme-lined immunosorbent assay；bombyx mori nuclear polyhedrosis virus；polyclonal antibody
家蚕核型多角体病毒是一种环状闭合双链DNA病毒，病毒粒子包埋于多角体蛋白中，这种包埋型多角体病毒（PDV）是家蚕个体间感染的病毒粒子表型［1］。因家蚕核型多角体蛋白可被目的基因替代，故人们利用杆状病毒作为载体，开发了杆状病毒-昆虫高效真核生物表达系统［2］；该系统操作简便，表达量高，在医药领域有较好的应用前景。为确保其安全性，需建立检测产品中残量病毒蛋白的测定方法，故我们研制了兔抗多角体病毒蛋白组份的多抗，并配以羊抗兔酶标抗体等，建立了快速、稳定、安全、灵敏度高的dot-ELISA测定法，并初步应用于家蚕生物反应器生产的细胞因子M-CSF等的残量多角体病毒蛋白组份的测定以及感染小鼠血清中多角体蛋白的检测。
1 材料与方法
1.1 材料 家蚕核型多角体病毒蛋白组份为多角体经碱液（0.06mol Na2CO3超速离心纯化获得，由中国农科院蚕业研究所提供。NC膜购自GIBCO，羊抗兔酶标体购自华美生物工程公司；动物：昆明小鼠18～20g／只，雌雄各半；家兔由本校动物部提供。
1.2 动物免疫 以多角体病毒蛋白为抗原，兔皮下和足垫注射，第1次用福氏完全佐剂乳化抗原注射50mg／每只，共5d；第2次同第1次；第3次直接隔天注射抗原7mg／只、14mg／只、2.8mg／只，共3d。1周后测定血清效价，放血收集多抗。
1.3 兔抗多角体病毒蛋白多抗的鉴定 用对流免疫电泳初步测定多抗的纯度，有3条区带，双扩的效价为1∶64，与正常人和兔血清无反应性，进一步用ELISA法滴定多抗及多角体蛋白，挑选最适工作浓度。
1.4 多角体病毒蛋白的dot-ELISA检测法［3］
1.4.1 试剂：固定液：10％的甲醇；洗涤液：0.01mol pH7.4含0.15mol NaCl磷酸缓冲液；稀释液：用洗涤液加5％的小牛血清；多抗作1∶32释稀使用，酶标抗体1∶50稀释使用；底物液：3，3-二氨基联苯胺，Tris-HCl配制；终止液：5％的冰醋酸。
1.4.2 样本：用稀释液稀释至各种浓度，取1μl点样，斑点含量分别是：2μg、1μg、500ng、100ng、50ng、10ng、1ng，测定样本蚕体血淋巴、蛹体血淋巴、初步纯化的细胞因子M-CSF为原浓度。
1.4.3 dot-ELISA的步骤：①点样后，用10％的甲醇固定5min；②5％的封闭液（pH7.6的0.02mol／L Tris-HCl缓冲液配制）37°C作用30min，用洗涤液洗3次。③加入1∶64稀释的自制多抗，37°C 40min取出洗涤3次；④1∶50稀释的羊抗兔酶标IgG，37°C作用40min，取出洗涤4次，加底物显色，用1％的冰醋酸终止反应。
1.5 包埋型多角体病毒感染小鼠 直接计数多角体病毒颗粒，每天分别用高（8×108／ml）、低（8×106／ml）两种剂量以及生理盐水给小鼠灌胃，每次0.2ml，共1周。每组小鼠7只，1周后取小鼠血清。
2 结果
2.1 ELISA间接法选择最佳工作浓度 用棋盘滴定法确定抗原、抗体的最适浓度，其中包被的多角体蛋白可稀释至1∶1000，抗多角体蛋白组份血清可稀释为1∶128，按ELISA法选定的抗原抗体工作浓度应用于dot-ELISA试验，但羊抗兔酶标IgG只作1∶50稀释。用已知不同含量的多角体蛋白点样，dot-ELISA检测结果呈明显梯度变化（见图1），最低可检测到10ng多角体蛋白。
图1 dot-ELISA检测结果
Fig1 Result of dot-ELISA
A、B、C、D：represent different samples
E、F、G、H、I、J、K：represent Bm-NPV control
2.2 初步应用 用该法分别测定蚕体血淋巴、蛹体血淋巴、初步纯化的细胞因子M-CSF（为原浓度）。结果在Bm-BaPAK6感染的蚕体血淋巴中检测到家蚕核型多角体病毒蛋白组份，含量约100ng／μl；在Bm-C80感染的蛹体血淋巴中也检测到家蚕核型多角体病毒蛋白组份，含量约50ng／μl；初步纯化的细胞因子M-CSF也呈弱阳性（见图1）。
2.3 包埋型多角体病毒检测 经包埋型多角体病毒感染1周的小鼠，取其血清原液以及10倍稀释的样本进行检测，结果在高／低剂量组均未检测到多角体蛋白。
3 讨论
家蚕核型多角体蛋白是包裹在病毒颗粒的表面的一种蛋白，对病毒颗粒具有保护作用，这种形式的病毒粒子称包埋型多角体病毒（PDV），是家蚕个体间感染的病毒粒子形式［4］。在病毒复制过程中，除主要产生分子量为29kd的家蚕核型多角蛋白外，还包括P10蛋白等少量相关蛋白［2，5］，故经超离存化的多角体蛋白是组份蛋白，用该组份蛋白制备的多抗，可用于检测是否有病毒的复制，以及经Bm-NPV表达系统表达纯化的产物中多角体病毒蛋白组份的含量［6］。本法成功地检测到经Bm-BaPAK6、Bm-C80感染的蚕体和蚕蛹的血淋巴中有多角体蛋白组份，该法的建立为家蚕基因表达系统生产的产品中多角体病毒蛋白组份的检测提供了一个高灵敏度的方法，且该法操作简便，样本需要量很少，可动态检测多角体病毒复制。在表达外源基因的重组克隆中，因外源基因替代了多角体蛋白，产物中应无多角体病毒蛋白，但在检测初步纯化的细胞因子M-CSF时结果为弱阳性，这可能是由于产品分离纯化后含有其它相关蛋白，因而制备的多抗可与之结合，使结果呈弱阳性。对经口灌胃的小鼠血清检测，未能检测到多角体蛋白，表明包埋型多角体病毒对小鼠无感染性，这与文献报道该病毒宿主高度特异性一致［4］。
［基金项目］863科学基金资助项目（102-11-02-06）
［作者简介］李卫党（1966-），男，江苏丹阳市人，讲师，博士生，主要从事分子免疫研究，现在上海第二医科大学免疫所，上海 200025。
何家禄（农业科学院蚕业研究所，江苏 镇江 212001）；季平（农业科学院蚕业研究所，江苏 镇江 212001）；
［参考文献］
［1］MORISHITA K，SAKANOR K，TAKEDA K，et al.Characterzation of V-sis protein express in silkworm larvae using the Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus vector［J］.J of Biochemistry，1990，1109：36～39.
［2］CHRISTOPHER DR.Baculovirus Expression Proto-cols ［M］.Humana Press Ine，1995.1～17.
［3］武建国.实用临床免疫学检验［M］.南京：江苏科学技术出版社，1990.19～40.
［4］吕鸿生.昆虫病毒分子生物学［M］.中国农业科技出版社，1998.447～455.
［5］MAEDA S.Expression of foreign genes in insects using baculovirus vectors［J］.Annu Rev Entomol，1989，34：351～372.
［6］WANG X，OOI BG，MILLER LK，et al.Baculovirus vectors for multiple gene expression and for occluded virus production［J］.Gene，1991，100∶131～137.
［收稿日期］1998-09-29；［修回日期］1999-10-08