双抗夹心免疫PCR法检测人促甲状腺激素(TSH)

双抗夹心免疫PCR法检测人促甲状腺激素(TSH)

免疫学杂志 2000年第2期第16卷 技术与方法

作者：杨 葵　周 棱　王衍真

单位：中国原子能院国家同位素工程技术研究中心，北京 102413

关键词：双抗夹心；免疫PCR；人促甲状腺激素(TSH)

　　摘　要：目的建立人促甲状腺激素(TSH)的免疫PCR方法。找到一种高特异性高灵敏度的简便快速的方法检测低浓度抗原分子。方法用单克隆抗体包被Eppendorf管，生物素化多抗和游离的亲和素作为连接分子，生物素化重组质粒作为指示分子，用特异引物扩增指示分子，同时与放射免疫技术、免疫放射技术和ELISA方法作比较。结果这种改进的免疫PCR技术可检测到1×10-16mol/LTSH含量比常规与法拉测下限增高了105倍。结论这种方法的应用也为临床大量样品的检测提供了可能。

　　分类号：R446．61　文献标识码：A

　　文章编号：1000-8861(2000)02-0144-04

Double antibodies sandiwich immuno-PCR detect TSH

YANG Kui ,ZHOU Ling,WANG Yan-zhen(The Nationbal Center for Isotope of Engineering and Technology,ChinaInstitude of Atonic Energy,Bei-jing 102413，China)

　　Abstract：Objective the double antibodies sandwich Immuno-PCR(IM-PCR)was constructed for detecting tSH．A high sensitivity method to investigate Ag existed in low concentration was found．Methods Coated eppenbdorf with mono-clone antibodies，used bio-polyclone antibodies to TSH and free avidin as linking molecules，bio-DNA as mark molecule，and amplified mark molecule with special primers． Finally compared modified IM-PCR to RIA，IRMA and ELISA methods at the same time， Results used the IM-PCR，nearly1×10-18mol/L TSH can be investiged which is more sensitive 105 times than routine methods．More sensitive 105 times than routine methods．Conclusion our IM-PCR also supplied possibility for detect-ing lots of samples in clinical assay.

　　Keywords：double antibodies sandwich；IM-PCR；TSH

　　SANO等人于1991年首次将PCR引入免疫反应，将抗原抗体反应与强大的扩增能力结合在一起实现了免疫分析方法的一大突破，理论上可检测到一个分子的抗原[1]。Htsh是判断甲状腺功能和下丘脑-垂体-甲状腺轴功能的指标之一，尤其是甲状腺功能低下的诊断，血清Htsh的测定有重要意义。由于TSH在正常人血清中含量很低，我们采用改进的双抗夹心免疫PCR技术检测TSH含量，提高其检测灵敏度和测定范围，并与常用放射免疫技术、免疫放射技术和ELISA方法做对照。

　　 1材料和方法 1.1材料生物素-N-羟基琥珀酰亚胺酯，二甲亚砜,辣根过氧化物酶,洗液(150mmol／LNaCl；20mmol／LTris-HClpH7．40；0．1％Tween20)，10×PCRBuffer(100m-mol／LTris-HClPh8．3；15mmol／LMgCl2；500mmol／LKCl100μg／mlGelatin)，亲和素(5mg，S-4762)、生物素(1g，B-4501)(Sigma公司)TSH单克隆抗体，多克隆抗体，人血清TSH放射免疫分析试剂盒，磁性TSH免疫放射分析药盒(本室自备)。特异上游引物5'GGCAGGAAGACAAACA3'；下游引物5'ACAGCACCACAGACCA3’,生物素化TSH基因重组质粒DNA(皓嘉公司)TaqDNA(5U/μl，250U)，dNTPmix(2mmol／L，500μl)，DNA小分子量标准(上海复兴公司)AgaroseMP(宝灵曼公司)正常人血清。

　　 1.2方法 1．2．1免疫PCR 1.2．1．1多抗的生物素化：BNHS溶液1mg／ml用DMSO配制[2]；待偶联的多抗于0．1mol／LNaHCO3pH9．6中配成1～2mg/ml后，与BNHS(1mg/ml)以8：1(v/v)混合，室温下搅拌4h，于0．05mol／LPBSpH7．2中透析过夜，加入0．02%NaN3，-30℃，55μl/管分装保存。

　　 1.2．1.2单抗的固定化：单抗用常规正辛酸法纯化后于0．05mol／L柠檬酸缓冲液Ph4．8中透析，稀释度为1.1×10-2、1:2×102、1：5×10-2、1:1×10-3、1：1×10-2、1：2×10-4、1：4×10-4、1：8×10-4、1：1×10-5．50μl/管加入Ep管(0．5ml)中，4℃过夜。

　　 1．2．1.3免疫PCR：弃去包被液后用洗液(150mmol/LNaCl；20mmol/LTris-HClPh7．4；0.1%Tween20)洗3次，按顺序加样(50μl/管)：首先加入正常人血清(稀释度分别为1:1×10-13、10-14、10-15、10-16、10-17、10-18、10-19)，37℃0．5～1h，洗管3次；再加入生物素化多抗(稀释度分别为1：500、1：1×10-3、1：1×10-4、1：2×10-4、1：4×10-4、1：8×10-4)温育和洗管操作同前；然后加入游离亲和素(浓度分别为5、2、1、0．5、0．1、0．05ng/ml)其余步骤相同；最后加入生物素化DNA(浓度分别为10、5、2、1、0．5、0．1、0．05ng/ml)，37℃1～2h洗管5次。弃净管口残留液后，依次加入上游和下游引物(各55pmol/μl)，10×PCRBuffer，4种Dntp(10mmol)，Taq酶(1U／μl)，加入双蒸水至50μl，并加入石蜡油25μl,1×104r/min离心5s后于PCR仪上扩增30个循环，其中第一次和最后一次循环分别为96℃2min；72℃5min。

　　 1.2．1.4琼脂糖凝胶电泳(AgaroseMP)：2％琼脂糖(含0．5％EB)，加样量为2μl,以不加TSH作为空白对照。

　　 1.2．2ELISA测定 1．2．2．1包被多抗：纯化后的多抗用。0.05mol／LNaHCO3pH9．6配成8μg／ml，包被于96孔酶标板中，4℃过夜(200μl／孔)。

　　 1．2．2．2ELISA：吸去包被液，用磷酸缓冲液(含Tween20，PBST)洗3次，加封闭液37℃1～2h后弃去，加入200μl／孔的正常人血清(稀释度分别为：1：1、1：2、1，4、1：6、1：6、1：10、：20)，4℃过夜，PBST洗3次后，加入200μl／孔酶标抗体37℃3h，弃洗同前，加入20μl/孔的底物液(A+B；A：TMB0．2mg/mlB：H2O31．2mmol／L)避光室温30min后，加入2mol／LH2S0450μl／孔终止反应，在酶标仪上测量。

　　 1.2．3放射免疫分析：操作过程参照说明书，正常人血清稀释度：1：1、1：2、1：4、1；6、1：8、1：16。

　　 1．2．4免疫放射分析；操作过程参照说明书，正常人血清稀释度：1：1、1：2、1：4、1：6、1：16、1：32 2结果 2．1IM-PCR法和3种常规方法测定结果放免，免放,ELISA测定结果见图1；免疫PCR测定结果见图2。

　　 图1TSH的3种检测结果对照 Fig1ComparisonofthreeroutinearalysisnfHtsh 图2琼脂汾凝胶电泳法分析TSHIM-PCR产物 Fig2AgarosegelelectrophoreticanalysisofPCR-ampli-fiedDNATSHshowingthesowingthesensi

　　tivityofIM-PCRbaseddetection．

　　 Lane1～3，1×10-17～1×1O-19mol/Lhumannormalscrum:lane4，distilledwaterintheabsenceofhumannor-malserum；lane5，molecularweightmarker，lane6～9.1×10-13～1×10-16mol/Lhumannormalserum 2．2IM-PCR检测TSH各试剂参考用量实验确定的各试剂的最佳浓度为：单抗：0．08μg/ml；生物素化多抗：40μg/ml；亲和素：0．1×10-3μg／ml；生物素化DNA：0．5×10-3μg／ml。

　　 2．3IM-PCR反应条件调整各步反应时间为0．5h,其中将加入Bio-DNA反应时间延长至1h。

　　 2．4各测定结果分析IM-PCR电泳结果TSH检测下限接近1×10-3mol／L，放免法对于TSH的检测下限是0．646mIU／L，即0.538×10-14mol／LTSH抗原分子；免放法对于TSH的检测下限是0．470mIU／L，即0．392×10-14mol／LTSH抗原分子；ELISA对于TSH的检测下限是0．490mIU／L，即0．408×10-14mol／LTSH抗原分子。改进的IM-PCR方法可检测到10-19mol／LTSH抗原分子。检测下限是常规方法的105倍。

　　 3讨论 传统免疫-PCR方法的基本流程为：包被抗原分子后依次加入生物素化抗体、连接分子和非特异ssDNA指示分子后，进行PCR扩增。该种方法存在产生非特异扩增的产物的可能，结果往往不准确。为我们对传统方法做了几项修改，将非特异扩增的可能性进一步降低,从而得到准确且高特异性的产物。①传统的免疫-PCR方法多是直接检测包被固相的标准抗原，但待检测抗原直接吸附固相的方法仅适用于吸附性良好的抗原，且样品中不能有过多的其他杂质。因此对于吸附性差或临床标本不能用该法[3～5]。本次实验采用目前国际上比较先进的双抗夹心的新吸附法：包被单抗后依次加入抗原分子、生物素化多抗、连接分子和DNA指示分子后扩增。包被单抗可提高抗原分子的吸附效率,且节省单抗用量，非常适用于临床样品的准确检测。②国际上目前免疫PCR技术主要是采用生物素-亲和素系统作为连接分子的方法[2]，但由于该法受系统本身价态问题影响，对实验条件和一些技术指标如连接分子比要求比较高,且重复性较差，同时较长的ssDNA片段对多抗的抗原结合位点和生物素结合位点的空间干扰一般不能确定，所以本实验未将生物素化多抗(Bio-PcAb)与生物素化ssDNA(Bio-ssDNA)预先用游离的亲和素(Avidine)形成复合物，而是采用正交实验方法确定各自的最佳稀释度。理沦上可将Bio-Avidine以1:4分子比连接，目前已有TSUNG等人将予混合法应用于GUD基因[6]，并取得较好结果。但预连接对于TSH检测是否有影响还有待检测。③DNA标记分子的序列、长度、类型对于准确扩增和高特异性结果是非常重要的。但传统的免疫PCR技术中并未对DNA标记分子性质给予必要的重视。在本实验中所使用DNA标记分子的序列，引物结合位点、长度和链数参照ROLFDJ的设计[5]，这一改进大大提高扩增准确性。同时引物序列的设计也是影响扩增的重要因素，引物不仅影响DNA产物生成，还影响扩增的特异性，本实验中的两个引物设计参照ROLFDJ的设计[5]，(G+C)%大约是50％，它们的Tm(52℃)分布曲线基本吻合。④本次实验中所有的反应，包括抗原抗体反应，所有的清洗步骤和扩增过程均在同一个Eppenbdorf管中进行，这一过程可以大大减少样品在转移过程中的损失[5]，我们的实验条件采用正交方法并借助文献报道确定基本用量[7],目的是在最佳稀释度和各种条件作用下取得较好的结果，以便降低成本,为临床和生产用量设立一个参考值(见结果2．1)。⑤以不加样品作为空白对照，排除残留管壁上的DNA扩增可能造成的不准确。从图2可以看出对照实验没有条带，说明在实验条件下基本可以得到高效特异性的PCR产物。由于PCR具有很强的扩增能力,要完全避免非特异结合Bio-PcAb或DNA标记分子是非常困难的[9]，所以每次洗管都是非常关键的步骤，尤其是在Bio-PcAb或DNA标记分子结合后应多冼几次并弃净管口残留液，本实验中同-Eppenbdorf管的使用以及清洗步骤很适于自动化生产需求。

　　 做如上几步改进后，可看出我们检测TSH的下限比常规方法高105倍,从而证明改进的步骤是有效的，同时各种试剂的最佳稀释度大大降低了实验成本，为临床大量样品的检测提供了可能。

　　 国际上免疫PCR技术近两年发展很快，主要用于检测体内激素、肿瘤、病毒、细菌、支原体、衣原体等。但对于PCR产物的定量测定仍是比较烦琐的，目前国际上的PCR定量方法主要有以下趋势：①紫外线消除法[9]：近距离和上方垂直照射可使传统PCR体系最低分辨率提高10～100倍。②毛细管区带电泳法(capillaryzoneelectrophresis,CZE)[10,11]:优点在于对于加的PCR产物样品可不经过纯化和浓缩操作，并且在分离缓冲液中含有低浓度的高分子物质，可提高DNA片段分辨率。③FAFELOSA(fluorescein-anti-fluoresceinbasedenzyme-linkedoligonueleotidesorbentassay)[12,13]：以生物素化寡核甘酸代替ELISA方法中的一抗，用酶标二抗检测荧光素标记的反转录链。④IP-RP-HPLC(ion-pairreverse-phaseHPLC)[14,15]：该法可对PCR产物立即进行分析，而不需要诸如标记等额外的操作，同时可以避免在毛细管区带电泳中透析、超滤操作造成的失误并节约大量时间。

　　 以上这些技术和定量方法由于受到设备和试剂的限制，目前主要用于实验室操作。同时在PCR技术中，每个循环中目的序列浓度的微小变化和Taq酶的作用，都会导致PCR产物不能准确反映起始管浓度。据文献报道，循环次数过多会造成扩增效应的明显减弱，所以找到一个方便并且适于临床和生产过程的免疫PCR技术和定量方法仍是我们免疫PCR实验的主要发展方向。

　　作者简介：杨 葵(1976-),女，黑龙江哈尔滨人,助工，本科，主要从事分子生物学研究。参考文献：

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收稿日期：1999-05-31

修稿日期：1999-09-30