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E．Coli DNA抗肿瘤免疫的实验研究
免疫学杂志 2000年第4期第16卷 基础免疫学
作者：赵越 江芳 张卓然
单位：赵越（大连医科大学微生物学教研室，辽宁 大连 116027）；江芳（大连医科大学微生物学教研室，辽宁 大连 116027）；张卓然（大连医科大学微生物学教研室，辽宁 大连 116027）
关键词：细菌DNA；肿瘤；免疫治疗
［摘 要］ 目的 探讨E．coli DNA抗肿瘤免疫的效果及免疫作用机制。方法 纯化提取大肠埃希菌染色体DNA（E．coli DNA）进行抗肿瘤治疗及免疫学指标测定。结果 E．coli DNA体内多种途径给药均可抑制肿瘤生长，增强正常小鼠NK细胞杀伤活性，在荷瘤小鼠亦测出NK／MΦ细胞的杀伤活性增强，对荷瘤所致的NK细胞功能下降有提高作用，还可诱生荷瘤小鼠体内γ-IFN，调节其TNF-α水平。结论 E．coli DNA具有抗肿瘤免疫特性，为微生物DNA制剂开发应用于抗肿瘤治疗提供了科学依据。
［中图分类号］ R730.51 ［文献标识码］ A
［文章编号］1000-8861（2000）04-0278-05
Experimental study on antitumor immunity with chromatic DNA fraction from E．coli
ZHAO Yue，JIANG Fang，ZHANG Zhuo-ran
（Department of Medical Microbiology，Dalian Medical University，Dalian 116027，China）
［Abstract］ Objective To investigate the effects of Escherichia coli（E．coli）on antitumor in vivo and the mechanism．Methods The chromatic DNA purified from Escherichia coli（E．coli）was used in the experiments of antitumor in vivo．Results E．coli DNA exerted strong antitumor activity against tumors by various ways．These were further verified by the pathological section of the tumor tissue with different degree of the necrosis areas．The primary study on immunity mechanism of antitumor activity of E．coli DNA augmented NK and MΦ cells activity．E．coli DNA can induce the production of γ-IFN and regulate the level of TNF-α．Conclusion E．coli DNA can be used on immunotherapeutic treatment of tumors．
［Key words］ bacterial DNA；tumor；immunotherapy
DNA是一种带有遗传信息的大分子，不同物种的DNA其免疫原性不同［1，2］。大肠埃希菌（E．coli）是一种肠道正常寄生菌，一般情况下不致病。纯化提取其染色体DNA（E．coli DNA）进行体内抗肿瘤治疗的动物实验，证实经多种治疗途径（SC，IL，IP）均具有抑瘤作用，并探讨其免疫作用机制，为细菌DNA疫菌应用于抗肿瘤免疫治疗增添新内容。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种：大肠埃希菌（ATCC 25922），本室保存。
1.1.2 动物：纯系BALB／C小鼠，6～8周龄，体重18～20g，雌雄各半，由大连医科大学动物中心提供。
1.1.3 瘤株：小鼠腹水型肝癌株（HCaF16A3），Yac-1，J62，Hela肿瘤细胞。
1.1.4 主要试剂：MTT试剂（FLUKA，瑞士），人γ-IFN ELISA检测试剂盒（Genzyme，美国），人TNF-α ELISA检测试剂盒（北京邦定生物医学公司）。
1.2 方法
1.2.1 E．coli DNA的提取与鉴定：与溶菌酶（1 mg／ml），10 ％SDS（1％）裂解菌体，饱和酚抽提去除菌体蛋白，透析，紫外分光光度计754测定OD260／280比值约为1.836；薄板层析显示E．coli DNA点样处未见脂多糖存在。可认为获得纯化E．coli染色体DNA。
1.2.2 荷瘤小鼠模型的建立：于小鼠右腋皮下接种HCaF16A3，106／0.2 ml／只。
1.2.3 E．coli DNA体内抑制率的测定：瘤内局部注射（IL）方案：将荷瘤小鼠随机分3组：TES组、BCG组、DNA组，于接种后第4 d，分别瘤内注射TES液、BCG液（0.25 mg／ml）、DNA液各0.3 ml，隔日1次，共8次，末次注射24 h后，各组小鼠分别取血、脾脏、腹腔冲洗液及肿瘤组织，测瘤重，固定标本作石蜡切片，HE染色，组织学观察。（注：TES为E．coli DNA缓冲液，组成为Tris-HCl，EDTA，NaCl）
腹腔注射（IP）方案：将荷瘤小鼠随机分3组：TES组、CY组、DNA组，于接种后第2 d，3组分别腹腔注射TES液、CY液（1.5 mg／ml）、DNA液各0.3 ml，隔2日1次，共8次，余处置同前。
局部实体瘤生长抑制率的计算：
抑制率＝（阳性对照组平均瘤重－实验组平均瘤重）／阴性对照组平均瘤重×100％
1.2.4 E．coli DNA对荷瘤小鼠生存期的影响：采用SC和IL两种途径，各分2组，即TES组、DNA组，接种后第4 d，分别注射TES、DNA各0.3 ml，隔日1次，共8次，观察小鼠生存率（90 d内仍存活）和死亡鼠的平均生存时间。
1.2.5 E．coli DNA体外直接细胞毒作用测定［5］：取HCaF16A3、Yac-1、Hela、J62，调细胞浓度为2×104 ／ml，实验孔加E．coli DNA分别至终浓度为100、50、25 μg／ml，阴性对照孔加TES，各设3个复孔，MTT比色法测定吸光度（OD值），检测波长595 nm，参考波长655 nm，按公式计算抑制率：
抑制率＝（1－实验孔OD值／阴性对照孔OD值）×100％
1.2.6 免疫指标的测定：
荷瘤小鼠脾脏NK细胞与腹腔MΦ细胞（NK／MΦ）细胞毒活性的测定：常规制备脾脏细胞和腹腔MΦ细胞，调整效应细胞浓度分别为NK细胞5×106 ／ml、MΦ细胞1×106／ml，靶细胞浓度分别为HCaF16A3 1×106 ／ml，Yac－1 2×106 ／ml，将效、靶细胞加入96孔板，各设3个复孔，MTT比色法测定OD值，按公式计算NK／MΦ细胞杀伤活性。
NK／MΦ细胞杀伤活性（％）＝［1－（A（E＋T）－A（E））／A（T）］×100％
荷瘤小鼠血清内γ-INF，TNF-α活性测定：应用人γ-INF ELISA试剂盒，人TNF-α ELISA试剂盒测定，均采用双抗体夹心酶联免疫检测法，结果经计算机处理（SAS软件，92版），得到血清中γ-IFN，TNF-α含量。
E．coli DNA对正常小鼠脾脏NK细胞杀伤活性影响的测定：将10只正常小鼠随机分两组：TES组、DNA组，IP途径分别注射TES、DNA各0.3 ml，隔2日1次，共8次，末次注射24 h后处死小鼠取脾，同前法测NK细胞杀伤活性。
1.3 统计方法 本实验数值为计量资料，两组生存期之间比较采用Logrank-test，其它数据中多组两两比较，采用q-test；两组比较，采用student-t-test（α＝0.05）。结果均以
2 结果
2.1 E．coli DNA体内抑瘤实验
2.1.1 E．coli DNA体内抑瘤率与病理切片中坏死面积的差别：各组小鼠肿瘤大小见图1～2。E．coli DNA体内注射后，肿瘤明显被抑制，经IL途径，DNA组瘤重（0.85±0.67 g）比TES组（1.76±0.65 g）减少（P＜0.05）；阳性药物BCG组瘤重（1.82±1.34 g）大于TES组瘤重。经IP途径，DNA组瘤重（0.97±0.85 g）比TES组（3.24±0.83 g）明显减少（P＜0.01）；阳性药物CY与DNA的作用无显著差异（P＞0.05）。经IL，IP两种途径，E．coli DNA抑瘤率分别为51.7％，70.06％；同时病理切片可见DNA组肿瘤组织坏死面积大于相应阳性对照药物组，大于相应TES组，与抑瘤率基本吻合。经IL途径的阳性对照药物BCG作用后，瘤重大于TES组，而病理切片中见BCG组肿瘤坏死面积大于TES组。
图1IL途径，TES、BCG、DNA 3组小鼠肿瘤大小的比较
Fig 1The tumor size of TES，BCG and DNA groups by IL way
图2IP途径，TES、CY、DNA 3组小鼠肿瘤大小的比较
Fig 2The tumor size of TES，BCG and DNA groups by IP way
2.1.2 E．coli DNA对荷瘤小鼠生存期的影响：E．coli DNA能显著延长存活时间，经SC途径，DNA组平均存活56.00±7．07 d，较对照组（21.25±5．70 d）有显著延长（P＜0.01）；于IL途径，DNA组平均存活52.00±2．74 d，较对照组（21.36±5．50 d）也有显著延长（P＜0.01）。而两种注射途径（SC／IL）之间的存活率无显著性差异（P＞0.05）。
2.2 E．coli DNA体外直接细胞毒作用比较 表1
结果表明：E．coli DNA对肿瘤细胞的直接作用与TES无显著差异（P＞0.05），提示E．coli DNA体外对肿瘤细胞无直接杀伤作用。
表1 E．coli DNA体外直接细胞毒作用OD（
Tab1 Test of direct cytotoxicity of E．coli DNA measured by MTT assay in vitro（
| tumor
cell |
E．coli DNA（μg／ml） | TES | ||
| 100 | 50 | 25 | ||
| HCaF16A3 | 0.685±0.009 | 0.684±0.007 | 0.685±0.005 | 0.684±0.009 |
| Yac-1 | 0.525±0.013 | 0.542±0.013 | 0.527±0.009 | 0.529±0.004 |
| Hela | 0.548±0.007 | 0.551±0.009 | 0.548±0.003 | 0.549±0.003 |
| J62 | 0.524±0.013 | 0.526±0.010 | 0.524±0.012 | 0.529±0.003 |
2.3 免疫指标的检测
2.3.1 E．coli DNA对正常小鼠体内NK细胞功能的作用：E．coli DNA体内注射后，正常小鼠脾脏NK细胞活性（52．4％±0.084％）较TES组（43.3％±0.055％）显著提高（P＜0.01），揭示E．coli DNA可以提高正常小鼠体内NK细胞活性。
2.3.2 E．coli DNA对荷瘤小鼠NK／MΦ细胞杀伤活性以及血清内γ-IFN，TNF-α含量的影响：见表2。
表2 荷瘤小鼠NK／MΦ细胞杀伤活性以及血清内γ-IFN，TNF-α含量
Tab 2 Influence of E．coli DNA on activity of NK／MΦ and serumal of γ-IFN／TNF-α with
mice bearing tumor in vivo
| group | injection
IL IP |
No of
mice |
activity of
NK（％） |
acivity of
MΦ（％） |
γ-IFN
（pg／ml， | TNF-α
（pg／ml， | |
| TES | ＋ | － | 8 | 32．52±0.14 | 28．62±0.18 | ＜0 | 125．836±17．453 |
| DNA | ＋ | － | 8 | 53.61±0.20 | 41.81±0.21 | 42．62±4.54 | 94.162±18．221 |
| TES | － | ＋ | 6 | 31.91±0.23 | 28．91±0.10 | ＜0 | 133.381±25．924 |
| DNA | － | ＋ | 8 | 55．61±0.23 | 47．92±0.13 | 92．39±7．48 | 102．151±12．042 |
note：t-test IL，P＜0.01， P＜0.001； IP：P＜0.01，P＜0.001 结果表明：E．coli DNA明显增强荷瘤小鼠NK／MΦ细胞杀伤活性，对荷瘤所致的NK细胞功能下降亦有提高作用。经IL，IP两种途径，DNA组血清γ-IFN含量（pg／ml）分别为42.62±4.54与92.39±7．48，而相应TES组则测不到。血清TNF-α含量，经IL注射，DNA组为94.162±18．221 pg／ml，与TES组（125．836±17．453 pg／ml）相比，显著降低（P＜0.001）；经IP注射，DNA组TNF-α含量为102.151±12．042 pg／ml，也较TES组（133.381±25．924 pg／ml）显著降低（P＜0.001）。
2.4 肿瘤组织的病理变化及电镜观察 见图3～图8。光镜下组织学观察可见（HE染色），IL、IP两种途径，TES组的小鼠肿瘤组织切片内见少量局灶状坏死区（＋～＋＋），瘤周组织内偶见淋巴细胞；阳性对照组（BCG／CY）瘤体内坏死区增大（＋＋～＋＋＋）；DNA组瘤体切片内见大片坏死区（＋＋＋～＋＋＋＋），坏死区周围可见淋巴细胞浸润。
图3IL途径，小鼠肝癌组织TES组的病理切片（HE×20）
Fig 3The pathological section of tumor tissue in TES group by IL way，HE×20
A few necrosis areas（＋～＋＋）formed in the tumor tissue and a few lymphocytes filtrated around the tumor．
图4IP途径，小鼠肝癌组织BCG组的病理切片（HE×20）
Fig 4The pathological section of tumor tissue in BCG group by IP way，HE×20
The necrosis areas enlarged（＋＋～＋＋＋）．
图5IL途径，小鼠肝癌组织DNA组的病理切片（HE×20）
Fig 5The pathological section of tumor tissue in DNA group by IL way，HE×20
Many necrosis areas（＋＋＋～＋＋＋＋）formed in the tumor tissue and many lymphocytes filtrated around the tumor．
图6IP途径，小鼠肝癌组织TES组的病理切片（HE×20）
Fig 6The pathological section of tumor tissue in TES group by IP way，HE×20
A few necrosis areas（＋～＋＋） formed in the tumor tissue and a few lymphocytes filtrated around the tumor．
图7IP途径，小鼠肝癌组织CY组的病理切片（HE×20）
Fig 7The pathological section of tumor tissue in CY group by IP way，HE×20
The necrosis areas enlarged（＋＋～＋＋＋）．
图8IP途径，小鼠肝癌组织DNA组的病理切片（HE×20）
Fig 8The pathological section of tumor tissue in DNA group by IP way，HE×20
Many necrosis areas（＋＋＋～＋＋＋＋）formed in the tumor tissue and many lymphocytes filtrated around the tumor．
3 讨论
人们公认，DNA是一种带有遗传信息的物质，但近十年来的研究证实，细菌DNA同时也是一种具有免疫特性的复杂大分子，并可作为生物反应修饰剂（BRM）［1］。深入实验证明，细菌DNA之所以诱导免疫反应，是其DNA内某种重复序列的结果，这种重复序列以非甲基化的CpG二核苷酸为核心，常被称为CpG motifs。细菌DNA的这种结构特点与哺乳动物DNA不同［2，3］。
在对细菌DNA免疫特性研究的启发下，本实验选用非致病性的大肠杆菌，提取纯化其染色体DNA，进行抗肿瘤的实验研究。动物体内抑瘤实验证明，通过多种途径（SC、IL、IP），E．coli DNA均具有效的抗肿瘤作用；病理切片可见，经E．coli DNA注射后，荷瘤小鼠肿瘤组织大片坏死，坏死灶周围见较多的淋巴细胞浸润；体外实验，当E．coli DNA含量达100 μg／ml时，对多种肿瘤细胞（人源，鼠源）均无直接杀伤作用，提示E．coli DNA的抑瘤作用主要由机体本身介导。
为探讨E．coli DNA抑瘤作用的免疫机制，本实验主要测定了NK／MΦ细胞杀伤活性，γ-IFN及TNF-α的含量等指标，结果显示：①NK细胞活性增强；②MΦ细胞活性增强；③E．coli DNA可诱导机体产生γ-IFN，调节TNF-α水平。提示E．coli DNA通过激活NK／MΦ细胞杀伤活性及诱生γ-IFN，有利于肿瘤细胞表面MHC分子的表达［4］，且形成-NK-IFN相互作用的正反馈环路，增强协同抗瘤能力。
关于细菌DNA免疫治疗的安全性，本实验观察到E．coli DNA经IL／SC两种途径注射后，无明显毒副反应，小鼠无一死亡；应用IP注射途径，需确定E．coli DNA在发挥其生物活性和产生毒副作用间的安全阈值。虽然细菌DNA及DNA疫苗是否对正常或异常机体产生不良影响是人们常质疑的问题，但目前已有不少学者认为：①以细菌为宿主细胞大量增殖的DNA疫苗，其结构并不完全等同于人类的DNA，例如具有不同的甲基化及不同的微量结合蛋白，不致于诱发机体产生高滴度的抗人DNA抗体；②据遗传统计学计算，基因插入染色体序列的位点机率将很低，不会高于人类自发性肿瘤发生的机率［5］；③细菌DNA进入机体产生的抗DNA抗体仅与细菌DNA本身特异性结合［6，7］。
综上所述，本实验证明：E．coli DNA具有很强的抑瘤作用，并可激活机体NK／MΦ细胞，诱生γ-IFN及调节TNF-α水平等，从免疫学方面初探了E．coli DNA抑瘤机制。关于E．coli DNA诱导机体产生的MΦ细胞与TNF-α之间的时间-剂量关系，寻找其生物学活性和毒副反应间的安全阈值将在下一步的实验中完成。E．coli DNA是否能通过体内直接或间接的方式诱导肿瘤细胞发生凋亡、如何进入细胞与胞内大分子发生作用、是否能继续在胞内复制表达、与宿主细胞内基因有怎样的关系等问题还需进一步研究和证实。本实验证实了细菌DNA的免疫调节特性，此领域的深入研究将对DNA疫苗、反义核酸以及基因免疫等应用和研究产生深远影响［8，9］。
［作者简介］ 赵越（1972－），女，辽宁沈阳市人，助教，博士生，主要从事类固醇受体的功能及调节的研究。
［参考文献］
［1］ ARTHUR MK，AE-KYUNG YI，SARA M，et al．CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B-cell activation［J］．Nature，1995，374（3）：546－549．
［2］ MOSMANN T．Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival：application to proliferation and cytotoxicity assay［J］．J Immunol Meth，1993，65（1）：55－60.
［3］ JOHN SC，JACQULINE HC，AE-KYUNG YI．Bacterial DNA induces NK cell to produce IFN-γ in vivo and increase the toxicity for lipopolysaccharides［J］．J Immunol， 1996，156（5）：4 570－4 575．
［4］ AE-KYUNG YI，JACQULINE HC，JOHN SC，et al IFN-γ promotes IL-6 and IgM secretion in response to CpG motifs in bacterial DNA and oligodeoxynucleotides［J］．J Immunol，1996，156（5）：558－564．
［5］ 卢 山.基因免疫［J］．上海免疫学杂志，1997，17（3）：132－134．
［6］ PISETSKY DS，DRAYTON DM．Deficient expression of antibodies specific for bacterial DNA by patients with systemic lupus erythematosus［J］．Proc Assoc Am Physicians，1997，17（3）：132－134
［7］ PISETSKY DS．Specificity and immunochemical pro-
perties of antibodies to bacterial DNA［J］．Methods，1997，11（11）：55－61．
［8］ KLINMAN DM，YI AK， BEAUCAGE EL， et al ．CpG motifs present in bacterial DNA rapidly induce lymphocytes to secrete IL-6，IL-12，and IFN-γ［J］．Proc Natl Acad Sci USA，1996，93（5）：2 879－2 883．
［9］ KLINMAM DM，YAMSHCHIKOV G，ISHIGATS-UBOP Y．Contribution of CpG motifs to the immunogenicity of DNA vaccines［J］．J Immunol，1997，158（8）：3 635－3 638．
［收稿日期］ 1998-04-06； ［修回日期］2000-04-12