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微载体培养MEK和Vero细胞试制甲肝灭活疫苗
免疫学杂志 2000年第4期第16卷 基础免疫学
作者：井申荣 尹卫东 万宗举 李成明 吴炳元 姜述德
单位：井申荣（中国医学科学院医学生物学研究所，云南 昆明 650118）；尹卫东（唐山怡安生物工程公司，河北 唐山 063000）；万宗举（中国药品生物制品检定所，北京 100050）；李成明（中国药品生物制品检定所，北京 100050）；吴炳元（中国医学科学院医学生物学研究所，云南 昆明 650118）；姜述德（中国医学科学院医学生物学研究所，云南 昆明 650118）
关键词：微载体；MEK细胞；Vero细胞；甲肝灭活疫苗；免疫原性
［摘 要］ 目的 探索微载体培养细胞大量制备甲肝病毒抗原及其灭活疫苗的可行性。方法 使用Cytodex-1培养恒河猴胚肾细胞和Vero细胞制备HAV，经过初步纯化、甲醛灭活、吸附佐剂，制成甲肝灭活疫苗，免疫昆明种小白鼠，测定免疫原性。结果 HAV X株和W株抗原滴度分别为1∶256、1∶128，感染滴度（logTCID50／ml）分别为8.50、8.17，与静止培养获得的滴度相当。小鼠抗HAV抗体第45 d达到峰值，滴度分别为1∶（96．0±78．4）、1∶（128．0±70.1）。结论 实验性甲肝灭活疫苗具有良好的免疫原性，应用微载体培养细胞制备甲肝灭活疫苗是可行的。
［中图分类号］ R329.24 ［文献标识码］ A
［文章编号］1000-8861（2000）04-0257-04
Preparation of inactivated hepatitis A vaccine with MEK and Vero cells cultured on microcarriers
JING Shen-rong1， YIN Wei-dong2， WAN Zong-ju3，LI Cheng-ming3，WU Bing-yuan1， JIANG Shu-de1
（1．Chinese Academy of Medical Science，Institute of Medical Biology，Kunming 650107，China； 2．Tangshan Yi’an Bioengineering Co．，Ltd．，Tangshan 063000，China； 3．National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products，Beijing 100050，China）
［Abstract］ Objective To investigate the feasibility of producing HAV and inactivated vaccine with cells cultured on microcarriers．Methods Macaca mulatta embryo kidney（MEK） and Vero cells cultured on Cytodex-1 grew confluent and were inoculated with HAV strains．The harvested virus was purified and inactivated by formaldehyde．Mice were immunized with two strains of experimental inactivated vaccines adsorbed to adjuvant．The immune response was detected by determination of antibody against HAV with ELISA method．Results Four weeks post inoculation with HAV strain X on MEK cells，strain W on Vero cells，HAV antigenic titers reached to 1∶256 in MEK cells and 1∶128 in Vero cells，and infective titers（logTCID50／ml） were 8．50 and 8．17，respectively．The HAV titers were almost the same as that obtained from stationary culture．The anti-HAV titers after 45 days in immunizing mice with inactivated HAV vaccine strains X and W were up to 1∶（96．0±78．4） and 1∶（128．0±70.1），respectively．Conclusion The experimental inactivated HAV vaccine has high immunogeni-city．It is feasible to produce HAV antigens and inactivated HAV vaccine with microcarrier culture techniques．
［Key words］ microcarriers； MEK cells； Vero cells； inactivated HAV vaccine； immunogenicity
甲肝灭活疫苗已经在西欧和北美等发达国家使用，其免疫原性良好，安全性可靠，预测引起的抗体可维持20年以上［1］。但甲肝灭活疫苗使用抗原量远大于减毒疫苗，而细胞培养甲肝病毒的周期长，静止培养和转瓶培养制备的细胞基质有限，HAV抗原产量亦受限制。微载体培养法是一种较理想的自动化、工业化生产疫苗的方法，但是国际上生产甲肝减毒活疫苗和灭活疫苗的细胞基质均采用人胚肺二倍体细胞，该细胞对生长条件的要求较严，难以用微载体进行大规模培养；Vero细胞繁殖快，已被WHO推荐用于疫苗生产，是公认的用于微载体培养的良好细胞基质。如果将微载体-Vero细胞反应器系统应用于生产甲肝病毒抗原制备甲肝灭活疫苗，那么将会充分满足市场对甲肝灭活疫苗的需求。为此我们应用微载体培养了Vero细胞和MEK细胞，小量制备甲肝病毒及其灭活疫苗，并检测其免疫原性。
1 材料和方法
1.1 细胞 Vero细胞，来源于ATCC，中国医学科学院医学生物学研究所保存，使用136-149代；MEK细胞：来源于中国医学科学院医学生物学研究所，为液氮冻存的次代猴胚肾细胞，复苏后使用。
1.2 甲肝病毒毒株 毒株W，在Vero细胞适应传代，抗原滴度为1∶512，感染滴度（logTCID50／ml）为8.44；毒株X，在MEK细胞适应传代，抗原滴度为1∶128，感染滴度（logTCID50／ml）为8.33。
1.3 培养液 生长培养液，Eagle’s MEM（含水解乳蛋白0.167％，10％新生牛血清、0.5％葡萄糖），pH7．22。维持培养液，前述培养基含2％新生牛血清、0.2％葡萄糖，pH7.30。
1.4 细胞培养和病毒培养 硅化搅拌瓶后，称取微载体Cytodex-1（Pharmacia公司产品）适量（按终浓度为3 mg／ml）水化、灭菌，加入所需细胞总数，置37 °C恒温室的磁力搅拌器进行悬浮培养至长成单层，加入HAV病毒悬液，37 °C下吸附2 h，补加维持培养液，35 °C连续搅拌培养。同时用相同的感染复数向小方瓶静止培养的细胞种毒，培养28 d收毒、测定。
1.5 HAV抗原滴度和感染滴度的测定 胰酶消化带毒细胞，反复冻融，超声破碎细胞，释放病毒，采用ELISA方法测定抗原滴度；感染滴度的检测使用35 cm2的细胞培养瓶增毒，培养28 d收毒，酶标法检测抗原，按Reech-Muench法计算logTCID50／ml。
1.6 甲肝灭活疫苗的制备 甲肝病毒悬液低速离心除去细胞碎片，氯仿抽提，病毒上清加入甲醛，37 °C连续搅拌灭活10 d，加入新鲜配制的Al（OH）3吸附病毒，离心弃上清，沉淀用生理盐水悬浮至所需的病毒浓度。
1.7 动物免疫 使用昆明种成年健康雌性小鼠，肌肉注射甲肝灭活疫苗W、X，并用HavrixTM Junior（史克必成有限公司，批号：VHA591A2）做为阳性对照，在15、30、45和60 d采血，分离血清，用ELISA竞争法检测总抗体。
2 结果
2.1 MEK细胞在微载体上的生长情况 MEK细胞在微载体上吸附6 h后，其贴壁率能达到36．95％（0.436×105／1．18×105），24 h后增加到78.2％。当MEK细胞在微载体生长至单层时，密度约为5．5×105 cells／ml。由图1可看出接种密度为1．5×105 cells／ml时，长成单层需要7 d，接种密度为1．18×105 cells／ml时，需要9 d时间。1．5×105 cells／ml组长成单层时细胞增长了4.2（6．3／1．5）倍，1．18×105 cells／ml组增长了4.9倍（5．84／1．18）。
图1微载体培养MEK细胞的生长曲线
Fig 1The growth curve of MEK cell cultured on microcarrier
1：inoculation with 1．5×105 cells／ml；2：inoculation with 1.18×105 cells／ml
2．2 Vero细胞在微载体上的生长情况 Vero细胞在微载体上吸附6 h后，贴壁率达83．87％，长成单层时，细胞密度约为8．0×105 cells／ml。对于1．5×105 cells／ml组需要7 d，0.8×105 cells／ml组需要9 d时间（见图2），前者细胞增加了5.3倍，后者增加了9倍；同时随着培养时间的延长，密度仍在增加。
图2微载体培养Vero细胞的生长曲线
Fig 2The growth curve of Vero cell cultured on microcarrier
1：inoculation with 1．5×105 cells／ml；2：inoculation with 0.8×105 cells／ml
2.3 MEK细胞在微载体上增殖HAV HAV X株在MEK细胞中的产量随时间的延长而在增加，28 d时抗原滴度为1∶256，感染滴度（logTCID50／ml）为8.50（见表1）。用相同感染复数的毒种接种静止
表1 HAV毒株W和X分别在Vero及MEK细胞上的抗原滴度和感染滴度
Tab 1Antigenic titers and infective titers of HAV strains W and X cultured on Vero and MEK cells
| strains／
cells |
culture
method |
antigenic titers／infective titers（logTCID50／ml） | |||
| 7 days | 14 days | 21 days | 28 days | ||
| W／Vero | microcarrier
stationary |
－NT
－／NT |
1∶2／3．23
1∶4／3．75 |
1∶64／7．75
1∶64／7．83 |
1∶128／8．17
1∶256／8．33 |
| X／MEK | microcarrier
stationary |
＋／NT
1∶2／3．56 |
1∶8／5．56
1∶32／6．17 |
1∶32／7．33
1∶128／8．17 |
1∶256／8．50
1∶256／8．56 |
＋：positive in ELISA test；－：negative in ELISA test；NT：not test．
培养的MEK细胞，28 d后收毒时的抗原滴度是1∶256，感染滴度为8.56，与微载体培养法获得的病毒滴度相当。2.4 Vero细胞在微载体上增殖HAV Vero细胞在维持培养甲肝病毒中基本上能保持在1．0～2．0×106 cells／ml左右，比种毒时细胞密度有所增加，而且细胞形态保持良好，没有出现细胞病变（CPE）。HAV W毒株在微载体培养和静止培养28 d后，抗原滴度达到1∶128，感染滴度（logTCID50／ml）为8.17，与静止培养相近（见表1）。
2.5 甲肝病毒的灭活 初步纯化的甲肝病毒，用1∶1 000的甲醛灭活HAV 10 d，抗原滴度从1∶4 056／100 ul下降到1∶256／100 ul，降低了16倍，对抗原性破坏很大；而使用甲醛1∶2 000和1∶4 000灭活HAV，ELISA检测灭活前及灭活10 d的病毒悬液，抗原滴度相同，没有破坏病毒的抗原性。1∶2 000的甲醛灭活HAV W和X株2 d，感染滴度迅速下降（见图3），3 d和5 d时，未能检测出活病毒，灭活10 d的样品经盲传3代，仍无法检测到甲肝病毒，说明甲肝病毒的感染性已完全消失。
图3HAV灭活动力曲线（1∶2 000甲醛，37 °C）
Fig 3The curve of HAV inactivated with 1∶2 000
formaldehyde at 37 °C
2.6 甲肝灭活疫苗的免疫原性 试制成的甲肝灭活疫苗，含Al（OH）30.5 mg／ml，抗原滴度为1∶1 280／0.5 ml，每只小鼠肌肉注射0.2 ml，阳性对照使用HavrixTM Junior（720EL U／0.5 ml），每只小鼠注射0.3 ml；每1疫苗株接种6只小鼠，仅免疫1次。实验期间，未见小鼠有异常反应。15 d时W、X和HavrixTM的阳转率分别为83.33％、83.33％和66.67％，30 d时小鼠全部阳转，抗HAV抗体在45 d达到峰值，滴度分别为1∶（128．0±70.1）、1∶（96．0±78．4）、1∶（83．2±38．4），60 d抗体滴度开始下降（见表2），结果表明：试制出的甲肝灭活疫苗在小鼠体内可以引起较高的抗体应答，具有良好的免疫原性。
表2 甲肝灭活疫苗免疫小鼠后的免疫原性
Tab 2 Immunogenicity of hepatitis A inactivated vaccine in mice
| inactivated
vaccine |
days after
vaccination |
responding
number／total |
seroconver-
sion rate（％） |
anti-HAV ELISA
titer（ |
| W | 15
30 45 60 15 |
5／6
6／6 6／6 6／6 5／6 |
83．33
100 100 100 83.33 |
1∶（19．6±11．3）
1∶（76．8±25．6） 1∶（128．0±70.1） 1∶（64．0±32．0） 1∶（8．8±6．3） |
| X | 30
45 60 |
6／6
6／6 6／6 |
100
100 100 |
1∶（38．6±23．6）
1∶（96．0±78．4） 1∶（69．3±28．7） |
| HavrixTM | 15
30 45 60 |
4／6
6／6 6／6 6／6 |
66．67
100 100 100 |
1∶（14．0±3．5）
1∶（76．8±43．4） 1∶（83．2±38．4） 1∶（64．0±32．0） |
3 讨论 生物制品尤其是疫苗的生产使用的细胞基质大多数是贴壁细胞，需要大量的表面积供给细胞贴附生长。传统的生产工艺采用静止培养，使用大量的罗氏瓶、转瓶等，占用空间很大，但提供细胞贴壁的表面积却极小，不适宜于工业化大生产；微载体培养技术的出现彻底克服了传统工艺表面积不足的限制，能在有限的空间内提供巨大的表面积，兼有静止培养和悬浮培养的优点，实现了培养操作的自动化控制，降低了污染的机会和减少了人力的投入，并且细胞在良好的生理状态下生长，可以获得高密度贴壁细胞，因此具有现代化大规模培养贴壁细胞的显著优势，是静止培养所无法比拟的。
应用微载体-Vero细胞制备甲肝灭活疫苗的首要工作是将甲肝病毒很好地适应到Vero细胞中，但甲肝病毒在Vero细胞中不易适应或是适应后病毒滴度不高、周期长［6］，迄今为止国际上尚未见到采用Vero细胞和微载体技术培养甲肝病毒的报道。为此我们从甲肝患者的粪便中分离并初步筛选出了Vero细胞适应株W和MEK细胞适应株X，在此基础上使用微载体培养Vero细胞和MEK细胞制备了甲肝灭活疫苗。
在用微载体培养细胞制备疫备时，一般细胞密度大于2×106 cells／ml才能用于生产［2，3］，但由于培养甲肝病毒的周期长（28 d），细胞密度高时易于聚集结块，不利于吸收营养，造成细胞活性差和HAV增殖缓慢，使得微载体培养的每个细胞的病毒产量低于静止培养［4，5］，因此，我们用微载体培养细胞和增殖HAV时的细胞密度都低于2×106 cells／ml，极少有聚集结块的现象，有利于病毒的复制。虽然每个细胞的HAV产量与静止培养相当，但由于微载体培养的细胞数量远大于静止培养，所以病毒总产量远远高于静止培养，对制备甲肝灭活疫苗带来极大的方便。
我们将病毒收获液用氯仿抽提后，可除去多数细胞物质，使用1∶2 000的甲醛浓度，37 °C作用10 d，可以彻底灭活甲肝病毒；吸附到Al（OH）3上，通过离心弃上清除去大部分残余的甲醛；仅免疫小鼠1次，30 d全部阳转，抗HAV抗体比减毒活疫苗免疫其它动物和人体的滴度高［7，8］，因此具有良好的免疫原性；一个半月后抗体滴度达到峰值，但此后开始下降，因此要获得持续较高的抗体水平，还需要加强免疫。
本文初步研究结果表明：应用微载体培养的MEK细胞及Vero细胞制备甲肝灭活疫苗都是可行的。随着进一步优化MEK细胞的培养条件以及HAV进一步在Vero细胞中的适应，病毒产量逐步提高，那么应用微载体-Vero细胞系统或MEK细胞系统在大型生物反应器中获得大量HAV抗原用于甲肝灭活疫苗的生产将成为现实。
［作者简介］井申荣（1968－），男，陕西蒲城县人，助理研究员，博士，主要从事病毒疫苗的基础研究。
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［收稿日期］1999-12-14； ［修回日期］2000-04-24