生物治疗中肿瘤浸润淋巴细胞端粒酶活性变化的研究

生物治疗中肿瘤浸润淋巴细胞端粒酶活性变化的研究

免疫学杂志 2000年第5期第16卷 临床免疫学

作者：李刚　王获程　李庆平　王贤德　王淑英　刘先玲　曾庆

单位：李刚（重庆三峡肿瘤防治研究所，重庆三峡中心医院，重庆 404000）；王获程（华西医科大学检验中心，四川 成都 610041）；李庆平（重庆三峡肿瘤防治研究所，重庆三峡中心医院，重庆 404000）；王贤德（重庆三峡肿瘤防治研究所，重庆三峡中心医院，重庆 404000）；王淑英（重庆三峡肿瘤防治研究所，重庆三峡中心医院，重庆 404000）；刘先玲（重庆三峡肿瘤防治研究所，重庆三峡中心医院，重庆 404000）；曾庆（重庆三峡肿瘤防治研究所，重庆三峡中心医院，重庆 404000）

关键词：肿瘤浸润淋巴细胞；生物治疗；端粒酶；端粒；肿瘤

　　［摘　要］　目的　研究肿瘤浸润淋巴细胞生物治疗中淋巴细胞端粒酶活性（telomerase activation，TA）变化的情况。方法　分离患者肿瘤浸润淋巴细胞以IL-2体外扩增后回输患者，同时随访疗效。应用TRAP-PCR检测TA。结果　发现肿瘤浸润淋巴细胞的TA明显高于肿瘤未浸润淋巴细胞TA（t＝2．819，P＜0.05），体外扩增淋巴细胞的TA 0.082±0.014明显高于肿瘤未浸润淋巴细胞TA 0.026±0.006（t＝12．81，P＜0.01）。回输30 d后的淋巴细胞TA与扩增前的肿瘤浸润淋巴细胞TA接近。端粒酶阳性扩增肿瘤浸润淋巴细胞生物治疗缓解率56．25％与有效率75．00％明显高于端粒酶阴性的扩增肿瘤浸润淋巴细胞生物治疗缓解率30.00％与有效率50.00％。结论　增殖培养可引起肿瘤浸润淋巴细胞端粒酶活性的改变，选择端粒酶阳性的体外扩增肿瘤浸润淋巴细胞进行生物治疗有希望进一步提高恶性肿瘤患者的生存率。

　　［中图分类号］　R70.43　　　［文献标识码］　A

　　［文章编号］1000-8861（2000）05-0370-03

Study of the changes of tumor infiltration lymphocyte telomerase activity during biological immunotherapy

LI Gang　LI Qing-ping　WANG Xian-de　WANG Shu-ying　LIU Xian-ling　ZENG Qing

　　（Sanxia Antitumor　Institute of Chongqing，Sanxia Central Hospital of Chongqing，Chongqing 404000，China）

　　WANG Huo-cheng

　　（Central Laboratory of West China University of Medical Science，Chengdu 610041，China．）

　　［Abstract］　Objective　To study the changes of lymphocyte telomerase activity（TA） during biological immunotherapy with tumor infiltration lymphocyte．Methods　Tumor infiltration lymphocytes were cultured with IL-2，and administered intraveinously on the 4th～8th day during IL-2 injection therapy.Clinical effects were　observed and analysed．TRAP-PCR was used to detect the TA of　tumor non-infiltration lymphocyte，tumor infiltration lymphocyte，tumor infiltration lymphocyte after in vitro-proliferation and tumor infiltration lymphocyte on 30th day after immunotherapy，respectively．Results 　TA of tumor infiltration lymphocyte was higher than that of tumor non-infiltration lymphocyte（t＝2．819，P＜0.05）.TA of tumor infiltration lymphocyte after proliferation was also higher than that of tumor non-infiltration　lymphocyte （t＝12．81，P＜0.01）．There is no significant difference between TA of tumor infiltration lymphocyte and tumor infiltration lymphocyte on 30th day after immunotherapy．The rates of completely relieved plus partially relieved（56．25％） and completely relieved plus partially relieved plus improved （75．00％）were higher in the group of　tumor infiltration lymphocyte with positive TA after proliferation than those （30.00％，50.00％）of tumor infiltration lymphocyte with 　negative　TA　after　proliferation．Conclusion　Proliferation in vitro　 results in the change of TA of tumor infiltration lymphocyte．It is possible to enhance further the survival rate of tumor patients using TA positive tumor infiltration lymphocyte after proliferation．

　　［Key words］　tumor infiltration lymphocyte；biological immunotherapy；telomerase；telomere；tumor

　　生物免疫治疗是治疗肿瘤的一种有效手段，努力提高免疫细胞的杀伤活性及增殖能力是肿瘤生物治疗的一项重要策略^［1］。端粒酶活性是评价细胞增殖能力的一项重要指标^［2］。有关淋巴细胞体外增殖培养时端粒酶活性的改变国外研究甚多^［3，4］，国内尚未见报道。为此我们研究了肿瘤浸润淋巴细胞生物治疗中淋巴细胞端粒酶活性的变化，为进一步提高肿瘤患者生物免疫治疗效果提供科学依据。

　　1　材料与方法

　　1．1　标本来源　肿瘤浸润淋巴细胞来源于60例恶性肿瘤病人，病例来源于1995年10月～1999年10月的住院患者，经临床、病理学及影像学检查确诊有远距离转移。男42例，女18例，年龄56±23岁，卡氏评分≥60分，预计生存时间大于3个月。头颈部恶性肿瘤20例，肾癌18例，肺癌10例，黑色素瘤5例，乳腺癌5例，纵隔肿瘤2例。肿瘤未浸润淋巴细胞来源于体检中心42例健康体检者，作为对照，经临床及影像学全面检查未发现肿瘤病变，男40例，女20例，年龄55±21岁。

　　1．2　体外扩增淋巴细胞的制备与治疗方案　应用血液成分分离机对60例恶性肿瘤病人及42例健康体检者经外周静脉抽取血液，离心分离血液细胞成分，留取富含白细胞的部分约200 ml，在实验室进一步应用淋巴细胞分层液分离，大约可分得1×10⁹～2×10⁹个淋巴细胞，取肿瘤未浸润淋巴细胞及部分肿瘤浸润淋巴细胞行端粒酶活性检测，剩余部分肿瘤浸润细胞以1×10⁶～2×10⁶／ml浓度接种在含有IL-2 1×10³ U／ml、5％人“AB”血清的RPMI1640培养液中，5％ CO₂，37 °C孵育，3～5 d后收集做无菌试验，洗涤后经0.5 Gy　γ线照射。方法参照文献［5］。取部分体外扩增淋巴细胞行端粒酶活性检测。58例患者回输治疗前每天应用IL-2 10～20万μ注射。于注射IL-2的第4～8 d开始回输体外扩增的肿瘤浸润淋巴细胞。30 d后再次取患者血液分离肿瘤浸润淋巴细胞，方法同上，行端粒酶活性检测。

　　1．3　端粒酶提取　取肿瘤未浸润淋巴细胞、肿瘤浸润淋巴细胞、体外扩增淋巴细胞、回输30 d后淋巴细胞1×10⁸～5×10⁸加入400 μl冷洗液（10 mmol／L Hepes-KOH pH7．5，1．5 mmol／L MgCl₂，10 mmol／L KCL，1 mmol／L DTT），混匀后，0 °C放置5 min，2　000 r／min 4 °C离心5 min，去尽上清液；加入预冷的裂解液200 μl（10 mmol／L Tris-HCL pH7．5，1 mmol／L　MgCl₂，1 mmol／L EGTA，5 mmol／L二巯基乙醇，0.5％ CHAPS，10％甘油），混匀后，放置0 °C裂解30 min，13 500 r／min 4 °C离心30 min吸取上清至一新预冷管中，采用BCA试剂盒（Sigma公司产品）进行蛋白质含量测定，放－80 °C冰箱保存。

　　1．4　端粒酶活性检测　采用TRAP法检测端粒酶活性，反应体积25 μl，反应体系含20 mmol／L Tris-Hcl（pH8．3），1 mmol／L MgCl₂，63 mmol／L KCL，0.005％ Tween-20，1 mmol／L EGTA，50 mmol／L DNTP，1 μgT4基因32蛋白，0.1 μg／ml BSA，74 KB q α32P-dCTP，2 U Taq酶和0.1 μgTS引物（5／-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3／）。加端粒酶提取物6 μg，混匀后于30 °C保温30 min，90 °C 90 s灭活端粒酶，加0.1 μg CX引物（5／-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA-3／），混匀后在PCR仪上进行31个循环，循环参数为90 °C 40 s，50 °C 40 s，72 °C 50 s，最后于72 °C延长10 min，加入6 μl电泳加样缓冲液，在10％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离后，凝胶与X射线胶片置－80 °C放射自显影，12 h后显示结果。同时取PCR产物5 μl与20 μl变性液混匀，在室温下作用10 min，加杂交液225 μl混匀，并取其100 μl加到酶标板的反应孔中，室温下反应2 h，洗净后加入HRP结合物，并洗净，加TMB底物显色30 min，在酶标仪上读出A450值。

　　1．5　疗效评价　治疗前及治疗后每1个月全面随访检查，治疗3次以上者计入疗效统计评价，共随访6个月。完全缓解（CR）：病灶完全消失；部分缓解（PR）：肿块缩小50％以上；好转（MR）：病灶减小25％，但不到50％；无效（NR）：肿块未增大或缩小不足25％或进展。

　　1．6 统计学分析　

　　2　结果

　　2．1　淋巴细胞端粒酶活性表达　端粒酶阳性表达者为间隔6 bp的梯形图象。端粒酶活性定性及定量检测结果见表1。

表1　　淋巴细胞端粒酶活性定性及定量检测结果（

　　Tab 1　Qualitative and quantitative determinations of number of telomerase activity positive and concentration of TA in tumor infiltration and tumor non-infiltration lymphocytes

group	n	positive 　　cases	positive 　　rate（％）	telomerse activity 　　（A450 nm）	t	P
Ⅰ	42	7	16．67	0.026±0.006
Ⅱ	60	15	25．00	0.048±0.009	2．819	＜0.05
Ⅲ	58	32	55．17	0.082±0.014	12．81	＜0.01
Ⅳ	52	16	30.77	0.041±0.010	2．828	＜0.05

　　Ⅰ：tumor non-infiltration lymphocyte；Ⅱ：tumor infiltration lymphocyte；Ⅲ：tumor infiltration lymphocyte after in vitro proliferation；Ⅳ：tumor infiltration lymphocyte on 30th day after immunotherapy2．2　疗效分析　60例恶性肿瘤病人，2例中途拒绝接受，58例接受体外扩增淋巴细胞治疗，3例治疗中途死亡，2例因TIL回输时出现发热副反应停止，1例随访失败。52例接受回输30 d后肿瘤浸润淋巴细胞端粒酶活性检测。治疗总缓解率46．15％，总有效率69．23％，端粒酶阳性与端粒酶阴性体外扩增淋巴细胞治疗缓解率两组分别56．25％、30.00％，经统计学处理，差异有显著性（χ²＝69．33，P＜0.01）有效率两组分别为75．00％、50.00％，经统计学处理，差异有显著性（χ²＝133．33，P＜0.001），结果见表2。

表2　　肿瘤浸润淋巴细胞生物治疗后患者疗效分析

　　Tab　2　Immunotherapy　efficiency of　telomerase positive　and negative tumor infiltration lymphocytes

TIL after vitro-proliferation	n	NR	MR	PR	CR	CR+PR 　　（％）	MR+PR+ 　　CR（％）
positive telomerase group	32	6	8	12	6	56．25	75．00
negative telomerase group	20	10	4	4	2	30.00	50.00
total	52	16	12	16	8	46．15	69．23

　　3　讨论　　肿瘤浸润淋巴细胞是一类新型有特异性的抗肿瘤效应细胞，并能在体外大量增殖，发挥杀伤肿瘤作用，但由于淋巴细胞的凋亡与部分肿瘤细胞的免疫耐受等原因阻碍着这一技术的临床作用^［6，7］。最新的研究发现，端粒酶与细胞分裂及寿命控制有密切关系。一般认为，在细胞癌变早期由于端粒酶活性增强，致使端粒的长度得以维持，细胞染色体形态得到稳定，从而逃避因端粒缩短而引起的细胞死亡，使细胞获得永生化；细胞的分化则伴随着端粒酶活性的降低。端粒酶活性是细胞增殖能力的重要指标^［2，8］。除肿瘤细胞中端粒酶高活性表达外，在正常人类生殖细胞、造血干细胞、外周血白细胞及淋巴细胞等具有再生能力的细胞中，均可检测到不同水平的端粒酶活性。外周血淋巴细胞中，端粒酶阳性检出率随细胞数的增多而增高，当细胞数为10³时，未检测出端粒酶活性；当细胞数为10⁵时，端粒酶阳性率80.6％^［4］，端粒酶活性阳性的淋巴细胞多处于高度增殖状态^［9］。

　　LUBE与NAKAZAWA的合作研究中发现；经增殖培养的人肾乳头细胞（HuG）中有端粒酶活性出现，而未经增殖培养的HuG细胞无端粒酶活性出现，说明端粒酶并非仅在肿瘤细胞中被激活，增殖培养同样可引起端粒酶活性的改变。我们研究结果表明：肿瘤浸润淋巴细胞与未浸润淋巴细胞相比，端粒酶活性有显著变化（t＝2．819，P＜0.05），体外扩增淋巴细胞与肿瘤未浸润淋巴细胞相比，端粒酶活性有显著增高（t＝12．81，P＜0.01），回输30 d后的淋巴细胞端粒酶活性恢复到扩增培养前水平（t＝1.47，P＞0.05），与肿瘤未浸润淋巴细胞相比，端粒酶活性有显著改变（t＝2．828，P＜0.05）。说明肿瘤浸润淋巴细胞的增殖能力高于肿瘤未浸润淋巴细胞的增殖能力，以IL-2体外扩增肿瘤浸润淋巴细胞可引起肿瘤浸润淋巴细胞端粒酶活性的显著增高。

　　输注体外扩增的肿瘤浸润淋巴细胞治疗恶性肿瘤患者总缓解率46．15％，总有效率69．23％，与文献报道一致^［5］。给肿瘤病人输注体外扩增的肿瘤浸润淋巴细胞，直接或间接介导肿瘤消退，是一种实验和临床都证明非常有希望的抗肿瘤生物学方法^［10］，毒副作用少而轻微，能整体改善病人的一般情况，提高免疫功能。临床疗效分析表明：扩增后肿瘤浸润淋巴细胞端粒酶阳性组治疗有效率（75．00％）与缓解率（56．25％）明显高于端粒酶阴性组治疗有效率（50.00％）与缓解率（30.00％）。端粒酶阳性的扩增肿瘤浸润淋巴细胞生物治疗效果明显优于端粒酶阴性的扩增肿瘤浸润淋巴细胞治疗效果。

　　肿瘤浸润淋巴细胞生物治疗作为肿瘤患者手术、放疗、化疗治疗的一种辅助治疗，已在一定程度上提高了患者生存率，选择端粒酶阳性的体外扩增肿瘤浸润淋巴细胞有希望进一步提高恶性肿瘤患者的生存率。

　　［作者简介］　李　刚（1970－），男，四川阆中市人，主治医师，本科，主要从事老年患者肿瘤生物治疗的研究。

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　　［收稿日期］　2000-01-10；　［修回日期］　2000-05-18