点击显示 收起
人心肌肌钙蛋白T胶体金免疫层析法的建立
免疫学杂志 2000年第5期第16卷 技术与方法
作者：李志梁 钱洪津 焦保明 姜朝新 陆青 王素华
单位：李志梁（第一军医大学珠江医院心内科，广东 广州 510280）；洪津（第一军医大学珠江医院心内科，广东 广州 510280）；焦保明（第一军医大学珠江医院心内科，广东 广州 510280）；姜朝新（第一军医大学珠江医院检验科，广东 广州 510280）；陆青（第一军医大学珠江医院心内科，广东 广州 510280）；王素华（第一军医大学珠江医院心内科，广东 广州 510280）
关键词：心肌肌钙蛋白T；胶体金；链霉亲和素；生物素；免疫层析法
［摘 要］ 目的 建立一种简便、快速、准确检测人心肌肌钙蛋白T（cTnT）的胶体金免疫层析法（GICA）。方法 制备的胶体金标记抗cTnT单克隆抗体3F7，生物素标记另一株抗体2H8，链霉亲和素结合于硝酸纤维素膜上，制成免疫层析试纸条。血清中cTnT与测试条两种抗体结合后，沿硝酸纤维素膜移动，与链霉亲和素交联形成肉眼可见的红色线条。结果 测试条灵敏度可达0.5 ng／ml。检测30例急性心肌梗塞（AMI）患者血清cTnT水平，并与国外同类产品比较，符合率达92％。结论 本方法特异性强、灵敏度高、简便快速，可广泛应用于急性心肌梗塞的早期诊断。
［中图分类号］ 392.33 ［文献标识码］ A
［文章编号］1000-8861（2000）05-0380-03
Development of a gold-immunochromatography assay for determi-nation of human cardiac troponin T
LI Zhi-liang QIAN Hong-jin JIAO Bao-ming LU Qing WANG Su-hua
（Department of Cardiovascular Disease ，Zhujiang Hospital，the First Military Medical University，Guangzhou 510280，China）
Jiang Chao-xin
（Department of Laboratory，Zhujiang Hospital，the First Military Medical University，Guangzhou 510280，China）
［Abstract］ Objective To develope a sensitive，rapid and simple gold immunochromatography assay（GICA）for determination of human cardiac troponin T （cTnT）in sera．Methods Colloidal gold was prepared and coupled with anti-cTnT monoclonal antibody 3F7．2H8，another monoclonal antibody，was biotinylated，streptavidin solidified to nitrocellose to prepare a test strip．cTnT in sera which combined with 3F7 and 2H8，migrates up the nitrocellulose strip after combination of serum cTnT and the two antibodies fixed on the test strip，two red lines were detectable to naked eyes．This was taken as positive．Results The sensitivity of GICA was 0.5 ng／ml．The Level of cTnT in 30 patients with acute myocardial infarction（AMI）were measured by this assay and also by using test kit supplied by Boehringer Mannheim Corp．The corresponding rate between the results using this method and that obtained by using products supplied by Boehringer Mannheim Corp was 92％．Conclusion This is a sensitive，specfic，simple and rapid assay for measuring cTnT．It may be used for early diagnosis of AMI．
［Key words］ cardiac troponin T；colloidal gold；streptavidin；biotin；immunochromatography
人心肌肌钙蛋白（cTnT）是90年代发展起来的一种新的诊断心肌缺血、坏死的高敏感性、高特异性的血清学指标［1］，其定量、定性测量方法已在国内外临床心血管领域广泛应用。目前国内应用这一测定方法的测试盒均依赖于国外产品。我们于1994年进行cTnT的基础和临床应用研究，在提取人cTnT、制备抗cTnT单克隆抗体的基础上，采用免疫层析技术，制成检测人cTnT的胶体金免疫层析（GICA）测试条并与宝灵曼产品比较分析，证明本方法具有简便、快速、准确等优点。
1 材料和方法
1.1 材料 氯金酸：北京化学试剂厂出品；链霉亲和素：BNHS：Sigma产品；cTnTT、I：本室从自愿者捐献心肌中提取［2］；抗cTnT单克隆抗体：本实验室经多次细胞融合制备［3］。从12株细胞株中筛选2H8、3F7两株进行本实验；cTnT定性标准测试条：Boehringer Mannheim Corp产品；血清标本：30例急性心肌梗塞（AMI）患者均有典型胸痛（时间＞30 min）、心电图改变及心肌酶学增高（CK-MB超过正常值2倍以上），并经选择性冠状动脉造影证实。所有病人血清标本均在入院时抽取，静置析出血清后即刻检测。50例对照组血清均为本院健康体检者。
1.2 方法
1.2.1 胶体金制备及抗cTnT抗体：根据参考文献［4］加以改进。三蒸水溶解氯金酸，加热至沸腾，至终浓度为0.01％，每100 ml加入10％柠檬酸三钠水溶液1．5 ml。再煮沸10 min呈橙红色，冷却后用0.2 mol／LK2CO3调至pH8．5，快速搅拌下加入纯化的3F7抗体IgG2 mg，加入牛血清的蛋白250 mg，快速搅拌10 min，加入10％NaCl，使NaCl的浓度为1％，摇匀，分别以2 000、4 000、10 000 r／min梯度离心，10 min／次，最后获得沉淀物即为初步纯化的金标记抗cTnT结合物，溶于储存液。
1.2.2 生物素化抗体2H8制备：根据参考文献［5］的方法加以改进为：按BNHS∶IgG＞（重量比）根据1∶7进行，室温搅拌3 h后，用pH7．2 0.05 mol／L PB溶液透析过夜，加等量甘油，－30 °C储存。
1.2.3 免疫测试条的制备：根据Müller-Bardoff法改进［6］。整个测试条由2层吸水纤维，1层硝酸纤维素膜，吸水滤纸及白色塑料垫板组成。吸水纤维使用前予0.5％BSA处理，上层吸水纤维点生物素化抗体2H8，下层吸水纤维点胶体金标记抗体3H7，硝酸纤维素膜上标记1∶100链霉亲和素（检测线）及兔抗鼠IgG（对照线），均为1 mm宽。晾干后用含1％新生牛血清的0.1 mol／L pH7．4 PBS封闭。干燥后依次粘在白色塑料片上。切成0.6 cm×10 cm条，－4 °C储存备用。
1.2.4 cTnT检测：新鲜血清0.5 ml滴入检测孔观察20 min。结果判定：以硝酸纤维素膜上出现两条红色为cTnT阳性；若有对照线红色为阴性；两条线均无显色为测试条失效。为检测其灵敏度，将cTnT抗原按0，0.1，0.2，0.5，1，10 ng／ml滴入测试孔，检测线出现红色则为最低可测定量。
2 结果
2.1 特异性 本测试条与cTnT，cTnI反应，显示仅与cTnT反应，与cTnI呈阴性反应。测定健康体检者有一例弱阳性反应。
2.2 灵敏度 当cTnT浓度高于0.5 ng／ml时，检测线为红色，示其最低检测值可达0.5 ng／ml（见图1）。
图1两种测试条检测cTnT
Fig 1Two assays detecting cTnT
A：Boehringer Mannheim Corp．assay；B：Colloidal gold immunochromatography assay．The level of cTnT antigen is 0.5 ng／ml．
2.3 稳定性 将测试条置入－4 °C 1个月后，与新制备的测试条比较无明显差异。
2.4 临床初步检测 30例AMI患者及50例健康体检者血清应用本测试条及国外同类产品比较，本测试条50例健康人血清中1例为弱阳性，符合率为96％；30例AMI患者，其中26例为阳性，符合率为86.66％（见表1，2）。
表1 急性心肌梗塞血清cTcT水平
Tab 1 Detecting results of serum cTnT both AMI and control groups
| group | sample
number |
this method | BMC method | ||
| positive
number |
positive
rate（％） |
positive
number |
positive
rate（％） |
||
| AMI | 30 | 26 | 86.66 | 30 | 100 |
| health control | 50 | 1 | 98 | 0 | 0 |
| Total | 80 | 27 | 33.75 | 30 | 37.5 |
BMC：Boechringer Mannheim Corp
表2 两种方法测定结果比较
Tab 2 Comparison of positive and negetive results in 80 sera using two assays
| this assay | BMCassay | total | |
| ＋ | － | ||
| ＋ | 26 | 1 | 27 |
| － | 4 | 49 | 53 |
| total | 30 | 50 | 80 |
BMC：Boechringer Mannheim Corp3 讨论
免疫层析技术是80年代发展的一种独特的免疫分析方式。以条状纤维层析材料为固相，通过毛细作用使样品溶液在层析条上泳动，当样品与纤维材料上相应的抗体相结合产生高特异、高亲和的免疫反应，并滞留或富集在检测区域，通过反应物而出现呈色现象，是一种目前发展最快的复合型免疫层析技术［7］。现在临床广泛使用的人绒毛膜促性腺激素（HCG）、乙型肝炎表面抗原（HbsAg）、可卡因等检测方法均是采用这类方法建立的，其优点是在于快捷、简便、准确，具有高度特异性及高敏感性。
本实验采用链霉亲和素固定于检测带，是根据链霉亲和素具有与各种生物素化抗体结合的能力，同时其四价性使其具有较高的放大系统，提高其敏感性和稳定性［6，7］。这对于检测血清中含有极微量（ng／ml水平）物质是极重要的。本实验是在建立了链霉亲和素-ELISA定量检测cTnT的基础上进行的，同时cTnT血清正常水平应在0.1 ng／ml以下，因此，不引入链霉亲和素是无法实现检测目的的，宝灵曼cTnT产品亦是采用这一方法而实现的。
胶体金免疫层析技术与ELISA技术原理不尽相同，前者技术要求更高，实施中更为困难。其主要原因在于：①胶体金免疫层析技术发展快，时间较短；②层析材料选择，处理至为重要。本实验采用国内外5种层析材料，其差异性较大，国内产品尚无法达到要求；③必须有较好的抗体及固定、稳定方法。
本测试条诊断临床急性心肌梗塞患者血清cTnT与国外同类产品比较符合率为86.66％，与冠状动脉结果比较，检测敏感性略低于国外同类产品，但基本达到临床早期快速、特异诊断的目的。目前这一国外产品价格昂贵，临床广泛开展和使用有困难。本方法的成功建立为国内城乡罹患心肌缺血、坏死患者的临床诊断提供新的手段，并具有广泛的应用价值。
［基金项目］ 广州市重点攻关项目（9724806）
［作者简介］ 李志梁（1958－），男，福建长汀县人，硕士，副教授，主要从事冠心病早期诊断和防治的研究。
［参考文献］
［1］ 杨振华．应考虑在缺血性心脏疾病中使用一些新的生化标记物［J］．中华心血管杂志，1997，25（5）：327－329．
［2］ 李志梁，付朝平，陆 青，等．人心肌肌钙蛋白T的纯化和鉴定［J］．第一军医大学学报，1996，16（2）：130－131．
［3］ 李志梁，付朝平，陆 青，等．人心肌肌钙蛋白T的纯化和单克隆抗体的制备［J］．生物化学与生物物理进展，1996，23（4）：459－461．
［4］ 蔡文琴，王伯云．实用免疫细胞化学与核酸分子杂交技术［M］．成都：四川科学技术出版社，1994．100－108．
［5］ 李成文．现代免疫化学技术［M］．上海：上海科学技术出版社，1992．160－168．
［6］ MULLER-BARDORFF M，FREITAGX H，SCHEFFOLD T，et al．Development and characterization of a rapid assay for bedside determinations of cardic of troponin T［J］．Circulation，1995，92（9）：2 869－2 876．
［7］ 吴冯波，侯惠仁，贺优丰，等．免疫层析分析进展［J］．中华医学检验杂志，1998，22（2）：122—127．
［收稿日期］ 1999-10-26； ［修回日期］2000-05-16