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慢性肾衰及血透中多肽生长因子与凋亡因子表达
免疫学杂志 2000年第5期第16卷 临床免疫学
作者：罗南萍 孙晓明 杨道理 徐军 安娟 刘桂香
单位：罗南萍（济南军区总医院免疫科，山东 济南 250031）；孙晓明（济南军区总医院免疫科，山东 济南 250031）；杨道理（济南军区总医院免疫科，山东 济南 250031）；徐军（济南军区总医院免疫科，山东 济南 250031）；安娟（济南军区总医院免疫科，山东 济南 250031）；刘桂香（山东桓台人民医院核医学科，山东 桓台 256400）
关键词：细胞凋亡；多肽生长因子；慢性肾功能衰竭；血液透析；流式细胞术
［摘 要］ 目的 探讨慢性肾功能衰竭（CRF）患者及血液透析（HD）过程中多肽生长因子及凋亡因子的含量变化及相互关系。 方法 采用流式细胞术及放射免疫分析法分别测定CRF及HD前后外周血单核细胞（PBMC）中Fas抗原（CD95）、线粒体膜蛋白（Apo2．7）、抗凋亡因子（BC1-2）蛋白的阳性细胞数及血清中转化生长因子α（TGF-α）、类胰岛素样生长因子（IGF-Ⅱ）的含量。结果 CRF（非透析组）CD95、Apo2．7、IGF-Ⅱ明显高于对照组。BC1-2与TGF-α含量均明显低于正常人（P＜0.01）。HD后CD95和Apo2．7表达明显高于HD前（P＜0.05），BC1-2蛋白在HD前后无差异（P＞0.05）。结论 多肽生长因子与凋亡因子在肾脏细胞凋亡过程中起重要作用。
［中图分类号］ R695.5；R446.6 ［文献识别码］ A
［文章编号］1000-8861（2000）05-0367-03
Expression of polypeptide growth factor and apoptosis factor in chronic renal failure and hemodialysis patients
LUO Nan-ping SUN Xiao-ming YANG Dao-li XU Jun AN Juan
（Department of Immunology，General Hospital of Jinan Military Region，Jinan 250031，China）
IU Gui-xiang
（Department of muclear medicine People’s Hospital of Huantai County，Shandong 256400，China）
［Abstract］ Objective To study the changes of levels of polypeptide growth factors and apoptosis factors in chronic renal failure and hemodialysis patients and the interrelationship between them．Methods Peripheral blood mononuclear cell content of Fas antigen（CD95），Apo2．7，BC1-2 positive and serum levels of TGF-α and IGF-Ⅱ were detected by using flow cytometry and radioimmunodetection respectively．Results Compared with normal controls，CD95， Apo2．7 and IGF-Ⅱ levels in CRF patients were significantly higher（P＜0.01），but BC1-2 expression was not affected by hemodialysis．Conclusion Polypeptide growth factor and apoptosis factor play an important role in the process of renal cell apoptosis．
［Key words］ apoptosis；polypeptide growth factor；chronic renal failure；hemodialysis；flow cytometry
细胞凋亡是正常T细胞和B细胞分化与稳定的重要机制。近年来研究表明：肾脏细胞的凋亡受许多细胞外部因素刺激。生长因子以及凋亡相关基因的调控，在肾脏发育过程中起重要作用，并参与许多肾脏疾病的发生［1］。为探讨多肽生长因子在肾脏细胞凋亡中的作用及机制，本文观察了在慢性肾功能衰竭（CRF）患者和血液透析（HD）过程中细胞凋亡因子Fas抗原（CD95）、线粒体膜蛋白（Apo2．7）与抗细胞凋亡因子（BC1-2）蛋白及转化生长因子（TGF-α）、类胰岛素样生长因子Ⅱ（IGF-Ⅱ）的表达特征，进一步探讨细胞凋亡因子与多肽生长因子含量变化及内在联系对肾脏疾病发生发展以及对血液透析的影响，旨为研究肾小球疾病开拓新的理论思路。
1 材料与方法
1.1 临床资料 CRF患者25例，男18例，女7例，平均年龄38.5±12．5岁。维持性HD患者（生长因子组）45例，男26例，女19例，平均年龄42.5±10.6岁，均来自本院血液净化中心。原发病分别为慢性肾炎26例，肾小动脉硬化7例，糖尿病肾病6例，肾盂肾炎4例，多囊肾2例。HD患者（细胞凋亡组）20例，男11例，女9例，平均年龄39.2±11．5岁。原发病分别为慢性肾炎11例，肾盂肾炎4例，糖尿病肾病2例，狼疮性肾炎6例，两组患者透析时间1～64个月（平均32个月）。全部患者内生肌酐清除率（CCr）均小于10 ml／min，每周透析3次，每次4～5 h。选择30例健康人作为对照组，男17例，女13例，平均年龄32.5±12．0岁。
1.2 方法
1.2.1 试剂：异硫氰酸荧光素（FITC）标记的鼠抗人单克隆抗体CD95、R-藻红蛋白（PE）标记的Apo2．7以及免疫阳性对照羊抗鼠IgG-FITC、IgG-PE。以上试剂均由法国国际公司提供。流式细胞仪为FACScan型（美国BD公司生产）。
1.2.2 外周血淋巴细胞提取：取晨空腹抗凝血2 ml，重悬于淋巴细胞分离液上，2 000 r／min，离心15 min，提取其中淋巴细胞层，再用PBS 3 ml漂洗2次，弃上清后调整细胞数为1×106／ml备用。
1.2.3 免疫反应：外周血分别加入细胞Apo2．7、CD95及IgG工作液，室温避光30 min，待测。
1.2.4 流式细胞仪检测：光源488 nm的氢离子浓度，上机前先用标准微球调整仪器，使变异系数在2％以内。上机后收集12 000个细胞，荧光强度以对数放大，光散射数据存盘。测试后用Cell Quest Plot软件（美国BD公司生产）分析，用HP12000／PS打印结果。
1.2.5 计算方法
1.3 统计学处理
实验数据以
2 结果
CRF、HD患者外周血CD95、Apo2．7及抗凋亡因子BC1-2蛋白含量变化见表1。HD前后血清TGF-α、IGF-Ⅱ表达见表2。
表1 CRF、HD患者与正常人外周血CD95、Apo2．7、BC1-2表达（
Tab 1 Expression of CD95、Apo2．7 and BC1-2 in CRF、
HD patients and normal controls（
| group | n | CD95（％） | Apo2．7（％） | BC1-2（％） |
| CRF | 25 | 1.58±0.80 | 3.86±3．36* | 12．62±4．0** |
| Pre-HD | 20 | 1.06±0.85 | 1.86±1．46 | 11.11±4．95** |
| Post-HD | 20 | 1.50±0.96 | 5.64±3．07**Δ | 12.19±4．95** |
| control | 30 | 0.47±0.09 | 1.12±0.63 | 38.94±4．02 |
*P＜0.05，compared with control；**P＜0.01，compared with control；Δ P＜0.05，compared with pre-HD
表2 HD前后血清TGF-α、IGF-Ⅱ含量变化（
Tab 2 Serum levels of TGF-α、IGF-Ⅱ in patients pre-and post-HD（
| groups | n | TGF-α（ng／ml） | IGF-Ⅱ（ng／ml） |
| control | 30 | 19.42±4.85 | 0.26±0.075 |
| pre-HD | 45 | 13.42±3.92 | 1.19±0.04 |
| post-HD | 45 | 21.22±5.76* | 1.32±0.56 |
*P＜0.01，compared with pre-HD3 讨论
CRF发病为多种因素综合作用的结果。肾脏细胞凋亡受许多外部因素刺激，生长因子以及凋亡相关基因的表达异常在肾脏疾病中起重要作用，并可能与Fas基因，BC1-2等作用有关［2］。本研究发现：CRF患者存在的凋亡因子异常表达与多肽生长因子含量变化有密切的关系。如表1所示：与30例正常人比较，CRF患者外周血中细胞凋亡因子CD95与Apo2．7阳性细胞数增高显著，而抗凋亡因子BC1-2蛋白在正常人外周血为38.94％±4．02％，CRF与HD组分别为12.62％±4.0％，11.11％±4．95％，明显低于对照组（P＜0.01）。KARAVANOV［3］报道：在缺乏肾生长因子，如上皮生长因子和胰岛素样生长因子时，肾小管上皮细胞发生凋亡，多种生长因子的丧失可能是急性和慢性肾小管凋亡发生的关键因素。本组实验HD组血清TGF-α水平明显下降与CD95、Apo2．7过度表达充分证实了这一论点，表明多肽生长因子是介导肾脏细胞凋亡的重要介质，证实细胞凋亡的发生可能与TGF等缺乏有关，故应用外源性生长因子来调节凋亡的发生并延长凋亡时间，对阻止肾小球浸润时中性粒细胞介导的肾小球损伤，阻止炎症所致的纤维化具有重要的临床意义。
CD95（Fas抗原）属肿瘤坏死因子受体家族成员，与Fas配体结合后迅速诱导Fas阳性细胞凋亡［4］。而Apo2．7抗原位于细胞线粒体上，此两种抗原均介导细胞凋亡，可能通过参与T、B细胞的阳性选择过程而影响免疫系统。本组结果显示：CRF外周血CD95、Apo2．7含量呈高度表达，而淋巴细胞减少是CRF患者常见的并发症之一，故CD95与Apo2．7介导的T细胞凋亡与其密切相关。非透析组外周血CD95阳性表达高于HD组，提示尿毒症时T细胞的凋亡可能通过Fas-FasL系统介导的，透析可拮抗Fas介导T细胞的凋亡作用，对缓解病人淋巴细胞减少有益。
BC1-2蛋白是在滤泡性淋巴细胞瘤中发现的，它能使细胞生存期延长和抵抗凋亡；与Fas作用相反，属抗凋亡因子［5］。在25例CRF患者外周血中，BC1-2蛋白阳性细胞数明显减少，与CD95增高呈负相关，表明CRF患者CD95与Apo2．7凋亡作用强于BC1-2的凋亡抑制作用，这种作用的增强有利于浸润中性粒细胞通过凋亡而被清除。BARKER等认为，诱导过度增生的肾小球系膜细胞凋亡可以达到控制系膜增生性肾炎的目的［6］。由于肾小球中表达Fas和Apo2．7抗原的主要是系膜细胞，Fas抗原过度表达与调节系膜细胞的增殖或凋亡密切相关［7］，故利用Fas、Apo2．7系膜的作用原理，可合成重组的FasL或协同剂，促使增多的肾小球系膜凋亡，抵抗BC1-2的抗凋亡作用，有可能达到阻止肾脏病进展的目的。
HD后患者CD95与Apo含量均明显增高，表明透析可作为治疗CRF的有效手段，能刺激HD患者Fas抗原增多，诱导肾小球系膜细胞凋亡，对缓解病情具有重要作用。同步检测CRF和HD患者外周血CD95、BC1-2、Apo2．7抗原及多肽生长因子含量对了解疾病的进展及判断疗效具有重要意义，并可作为衡量HD质量的良好观察指标。
［作者简介］ 罗南萍（1951－），女，江西吉水县人，副主任技师，本科，主要从事细胞因子及神经肽的临床研究。
［参考文献］
［1］ 刘 彬.肾脏细胞的凋亡［J］．中外医学生理病理科学与临床分册，1998，18（3）：252－255．
［2］ NAGUTA S，GOLSTEIN P．The Fas death factor［J］．Science，1995，267（10）：1 449－1 456．
［3］ KARAVANOV A，SAINIO K，PALGI J ，et al．Neurotrophin3 rescues neuronal precursors from apoptosis and promotes neuronal differentiation in the embryonic metanephric kidney．Proc Natl Sci USA，1995，92（24）：11 279－11 283．
［4］ LU QL，POULSOM R，WONG L，et al．BC1-2 expression in adult and embryonic nonhaematopoietic tissues［J］．J Pathol，1993，169（4）：431－437．
［5］ TSUJIMOTO Y，CROCE CM．Analysis of the structure，transcripts，and protein produts of BC1-2，the gene involved in human follicular lymphoma［J］．Proc Natl Acad Sci USA，1996，83（11）：5 214－5 219．
［6］ BARKER AJ，MOONEY A，HUGHES J，et al．Mesangial cell apoptosis：The major mechanism for resolution of glomerular hypercellularity in experimental mesangial proliferative nephritis［J］．J Clin Invest，1994，94（5）：2 105－2 116．
［7］ LOS M，VANDE GRAEN M，PENNING LC，et al．Requirement of an ICE／CED-3 protease for Fas／Apo-1-mediated apoptosis［J］．Nature，1995，375（6 526）：81－83．
［收稿日期］ 2000-02-22； ［修回日期］ 2000-05-04