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抗TCRαβ单抗促进异基因皮肤移植耐受的研究
免疫学杂志 2000年第5期第16卷 基础免疫学
作者：郝洁 赵伟 刘彦平 张庆殷 郭宏伟 谢蜀生
单位：郝洁（北京医科大学免疫学系，北京 100083）；赵伟（北京医科大学免疫学系，北京 100083）；刘彦平（青海医学院微生物学与免疫学教研室，青海 西宁 810001）；张庆殷（北京医科大学免疫学系，北京 100083）；郭宏伟（北京阜外医院心外科，北京 100037）；谢蜀生（北京医科大学免疫学系，北京 100083）
关键词：免疫耐受；皮肤移植；抗TCRαβ单抗
［摘 要］ 目的 探索抗TCRαβ单抗诱导异基因成年小鼠皮肤移植耐受的作用。方法 经C57BL／6（H-2b，B6）小鼠尾静脉注射BALB／c小鼠（H-2d）脾细胞，2 d后腹腔注射环磷酰胺（CP），随后两次尾静脉注射抗小鼠-TCRαβ的单克隆抗体，然后进行皮肤移植，观察皮肤存活期并对耐受小鼠的MLR、DTH等耐受状态进行了检查。结果 耐受B6小鼠获得了供体特异性皮肤移植耐受，供体皮肤移植存活时间明显延长，MLR和DTH检查证明B6小鼠对BALB／c小鼠的脾细胞的反应性、特异性降低，而仍保持对无关第三者小鼠的免疫反应。结论 使用注射脾细胞，环磷酰胺及抗TCRαβ单抗的方法在B6小鼠体内可以成功地诱导出对供体的皮肤移植耐受。
［中图分类号］ R392．4 ［文献标识码］ A
［文章编号］1000-8861（2000）05-0331-03
Study on the effect of anti-TCRαβ monoclonal antibody in the induction of transplantation tolerance to the allogeneic skin graft
HAO Jie ZHAO Wei ZHANG Qing-yin XIE Shu-sheng
（Department of Immunology，Beijing Medical University，Beijing 100083，China）
LIU Yan-ping
（Department of Microbiology and Immunology，Qinghai Medical University，Xining 810001，China）
GUO Hong-wei
（Department of Surgery，Beijing Cardiovascular Institute and Fuwai Hospital，Beijing 100037，China）
［Abstract］ Objective To explore the method of inducing the tolerance of skin grafts between allogeneic adult mice． Methods The spleen cells of BALB／c mice （H-2d） were injected to C57BL／6 mice （H-2b，B6） via the tail vein． Two days later，an intraperioneal injection of cyclophosphamide （CP） was given to the B6 mice，and following two consecutive anti-TCRαβ monoclonal antibody injections via the tail vein，skin grafts of BALB／c mice were transplanted to the B6 mice． To observe the survival time of the skin grafts，MLR and DTH were examined to confirm the tolerant state of B6 mice． Results The tolerant B6 mice acquired specific tolerance to the skin grafts of the donor BALB／c mice． The survival time of the allogeneic skin grafts prolonged significantly． The results of MLR and DTH indicated that the B6 mice acquired specific tolerance to the spleen cells of the BALB／c mice，but the immune responses to the spleen cells of the irrelevent KM mice remained normal． Conclusion The spleen cells，CP combined with anti-TCRαβ monoclonal antibody can successfully induce the specific tolerance to the skin grafts of the BALB／c mice in the B6 mice．
［Key words］ immune tolerance；skin graft；anti-TCRαβ monoclonal antibody
在同种器官移植中，T细胞是介导急性移植排斥的主要的效应细胞。通过TCR／CD3复合物和抗原呈递细胞MHC分子呈递的抗原肽的结合，是T细胞活化的抗原信号（或第一信号），活化的T细胞增殖，分化为效应细胞，导致移植排斥［1］。在本实验中，我们在供体脾细胞加环磷酰胺诱导浅度耐受的基础上，联合应用抗小鼠T细胞受体的单抗（anti-TCRαβ mAb），显著地延长了异基因皮肤移植物的存活期。
1 材料与方法
1．1 动物 C57BL／6（B6）小鼠（H-2b），BALB／c小鼠（H-2d），KM小鼠，北京医科大学实验动物部提供，所用各品系小鼠均为雌性，8～10周龄。
1．2 试剂 环磷酰胺（CP），上海华联制药有限公司产品。单克隆抗体：anti-TCRαβ mAb，由杂交瘤细胞H57-597分泌；IgG：购自ATCC公司，由本室注射经处理的BALB／c小鼠腹腔后取腹水，并纯化，－20 °C保存。
1．3 耐受诱导 B6小鼠尾静脉注射108BALB／c脾细胞（SC），2 d后腹腔注射CP 200 mg／kg，之后第2 d和第4 d分别经尾静脉注射抗TCRαβ单抗，剂量为400 μg／0.5 ml。
1．4 皮肤移植 在最后一剂抗TCRαβ单抗后第3 d，B6小鼠接受BALB／c小鼠的皮肤移植，皮肤移植方法参照参考文献［2］方法进行，以皮片完全干缩或结痂作为排斥的标准，结果用皮片平均存活时间（MST）
1．5 单向混合淋巴细胞反应（MLR） 参照参考文献［3］。以下列公式计算刺激指数（stimulation index，SI）：
SIAmB＝AmBcpm／BmBcpm
SIAmB代表A细胞刺激B细胞的刺激指数，即A刺激B反应的cpm值除以B被自身刺激细胞（Bm）所刺激的cpm值。
1．6 迟发型超敏反应（DTH）的测定 5×107／ml异基因脾细胞0.2 ml腹部皮下致敏，6 d后50 μl 2×108／ml脾细胞一侧后脚掌攻击，对侧脚掌注射50 μl生理盐水，24 h后游标卡尺测两脚掌厚度，取其差值（footpad increment，FI）作为DTH指标。
2 结果
2．1 B6小鼠对BALB／c小鼠皮肤移植物产生耐受 BALB／c小鼠皮肤移植给正常B6小鼠，11 d左右即被排斥；脾细胞+CP组合不能延长皮肤移植物的存活期；单纯应用抗TCRαβ单抗组小鼠，皮肤移植物平均存活29．5 d；当脾细胞+CP+抗TCRαβ单抗3种成分同时应用时，皮肤移植物存活时间明显延长，平均达67．4 d，其中1只小鼠的皮肤移植存活80 d。所有耐受的黑色B6小鼠背部的BALB／c小鼠皮肤都于移植后3周开始长出白毛，显示受体完全接受了移植物。值得注意的是，无关品系KM小鼠的皮肤移植物也平均存活30.8 d，虽然明显低于BALB／c小鼠皮肤移植物存活的平均67．4 d，但也显示了用抗TCRαβ单抗的非特异免疫抑制作用。与对照各组比较，脾细胞+CP+mAb组小鼠的皮肤移植存活时间明显延长，表明这种方法有效地诱导了对供体组织的移植耐受（见表1）。
表1 BALB／c小鼠皮肤移植物在耐受B6小鼠存活期
Tab 1 The survival time of skin allografts of BALB／c mice in tolerant B6 mice
| group | SC
1×108 iv |
CP
200mg／kg ip |
MAb
400μg×2 iv |
donor of
skin graft |
n | MST（ （d） |
| 1 | － | － | － | BALB／c | 8 | 11．4±0.7 |
| 2 | + | + | － | BALB／c | 5 | 13．4±1．8 |
| 3 | － | － | + | BALB／c | 5 | 29．4±3．2 |
| 4 | + | + | + | BALB／c | 5 | 67．4±8．0* |
| 5 | + | + | + | KM | 5 | 30.8±2．6 |
*P＜0.001，compared with groups 2，3 and 5；SC：number of spleen cells given；MST：mean survival time2．2 耐受小鼠脾细胞对供体的混合淋巴细胞反应特异降低 耐受后15 d，全身免疫抑制尚未解除，MLR也相应处于抑制状态，耐受B6小鼠对供体BALB／c小鼠和KM小鼠的MLR均处于明显抑制状态，而在耐受诱导35 d时，对BALB／c小鼠的MLR仍处于低水平状态，只有正常对照小鼠的23％左右。而对无关第三者KM小鼠的MLR则已有较大程度的恢复，达到正常小鼠的70％左右。可见随着抗TCRαβ单抗非特异抑制作用的消失，耐受小鼠脾细胞明显特异地降低了对供体淋巴细胞抗原刺激的增殖反应（见表2）。
表2 耐受小鼠对异基因脾细胞的混合淋巴细胞反应
（
Tab 2 MLR to allogeneic spleen cells in tolerant mice
（
| SC→RC | SI（d） | ||
| normal
control |
15 | 35 | |
| BALB／c→B6 | 5．92±0.51 | 1．05±0.34* | 1．54±0.32* |
| KM→B6 | 5．28±0.38 | 1．29±0.49# | 3．75±1．05## |
*P＜0.01，compared with BALB／c→B6 normal control；#P＜0.01，##P＞0.05，compared with KM→B6 normal control；SC：stimulating cells；RC：responding cells；SI：stimulation index2．3 供体特异的迟发型超敏反应降低 迟发型超敏反应在移植排斥过程中起重要作用。分别于耐受诱导后15 d和35 d检查了B6小鼠对BALB／c小鼠和KM小鼠的DTH反应，得到了与MLR检测相似的结果，耐受B6小鼠对KM小鼠的DTH反应可于诱导后35 d大部分（达正常的70％以上）恢复，而对BALB／c小鼠的DTH反应仍特异性降低（只有正常的30％左右）（见表3）。
表3 耐受小鼠对异基因脾细胞的迟发型超敏反应
（
Tab 3 DTH to allogeneic spleen cells in tolerant mice
（
| sensitized
spleen cells |
FI（d） | ||
| normal
control |
15 | 35 | |
| BALB／c | 1．04±0.06 | 0.19±0.04* | 0.27±0.05* |
| KM | 0.92±0.05 | 0.29±0.07# | 0.69±0.13## |
*P＜0.01，compared with BALB／c→B6 normal control；#P＜0.01，##P＞0.05，compared with KM→B6 normal control3 讨论
MAYUMI等建立的“cells-followed-by-CP system”是通过静脉注射供体脾细胞，使能与抗体抗原发生反应的受体T细胞克隆活化和增殖，并被2 d后腹腔注射的CP选择性地破坏［4］。这种耐受诱导方法虽然是供体特异的，但其诱导的耐受深度不够，不能使完全异基因小鼠皮肤移植物的存活期延长［5，6］。NOMOTO等利用一个小鼠模型观察了抗TCRαβ单抗的抗移植排斥作用，发现单独使用抗TCRαβ单抗可以延长异基因皮肤移植物的存活期，但只能维持35．6 d，表明了只应用该单抗的局限性［7］。研究表明：对于抗原刺激，受体体内有一类T细胞增殖能力较弱，而活化后很快就转化为记忆细胞，因此不易被随后注入的CP所杀死。供体和受体间存在的抗原性的差异越大，在“cells-followed-by-CP system”中CP处理后保存下来的这种细胞就越多［8，9］，因此在H-2完全不同的小鼠间的皮肤移植物的存活期不能延长。有研究发现，在用供体细胞和CP诱导耐受前后使用抗T细胞单抗，可以减少保存下来的记忆性的T细胞［10］。本文在细胞+CP的系统的基础上，联合应用抗TCRαβ单抗，也获得了异基因BALB／c小鼠皮肤移植物在耐受的B6小鼠存活时间明显延长（见表1），B6小鼠对BALB／c小鼠的MLR和DTH在耐受诱导35 d后仍保持特异性抑制状态。相比之下，耐受小鼠对异基因无关第三者KM小鼠的皮肤移植虽然也明显延长，但存活时间仅有约30 d，排除了抗TCRαβ单抗的非特异抑制作用，相似的结果也被MLR和DTH反应的检测结果所证实，说明抗TCRαβ单抗可以明显增强移植耐受的诱导。
［基金项目］ 国家自然科学基金重点项目（39830340）
［作者简介］ 郝 洁（1968－），女，北京市人，主管技师，在读硕士研究生，主要从事移植耐受的研究。
［参考文献］
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［收稿日期］ 2000-04-17； ［修回日期］ 2000-06-13