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EphB2受体N端Ig类似区基因的克隆和序列测定

来源:细胞与分子免疫学杂志
摘要:EphB2受体N端Ig类似区基因的克隆和序列测定细胞与分子免疫学杂志2000年第1期第16卷分子免疫学作者:张晓光董巨莹茹晓荣药立波刘新平苏成芝单位:张晓光董巨莹茹晓荣药立波刘新平苏(第四军医大学生物化学与分子生物学教研室,陕西西安710032)关键词:EphB2。基因克隆。EphB2是1994年Kiyokawa等[3]从......

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EphB2受体N端Ig类似区基因的克隆和序列测定

细胞与分子免疫学杂志 2000年第1期第16卷 分子免疫学

作者:张晓光 董巨莹 茹晓荣 药立波 刘新平 苏成芝

单位:张晓光 董巨莹 茹晓荣 药立波 刘新平 苏(第四军医大学生物化学与分子生物学教研室,陕西西安710032)

关键词:EphB2;基因克隆;酪氨酸蛋白激酶受体;PCR

  中图号:Q78 文献标识码:A

  文章编号:1007-8738(2000)01-0027-28

  Eph家族是最大的酪氨酸蛋白激酶受体家族[1],已有14个成员,在神经轴突导向、血管发生及肿瘤形成等方面具有重要的功能[2]。EphB2是1994年Kiyokawa 等[3]从构建的胃癌组织cDNA文库中,筛选出的EPH亚类中又一新基因,在各种肿瘤组织中的表达均高于相应正常组织数倍。EphB2和其跨膜配体ephrinB1(formerly ElkL/Lerk2)与神经轴突的发育路径有关。其胞外球状结构域的晶体结构表明,该区是与其配体结合的关键结构域,可折叠形成蛋卷(jellyroll)三明治的空间构型[4]。实验证明,EphB2的C端可与ras结合蛋白AF6的PDZ结构域结合,并在NIH 3T3 和 NG108 细胞中以配体依赖的方式磷酸化AF6[5]。但其作用机制和生理功能的研究尚有许多空白。我们设计、合成了引物,扩增出其胞外Ig类似区基因并克隆,为进行表达,寻找新的配体,揭示该基因参与的信号传递过程,和阐明其生物学功能奠定了基础。

  1 材料和方法

  1.1 材料 pBluescript(-)质粒和DH5α菌种均由本室保存。胃癌手术切除标本,由本校西京医院普通外科提供。DNA重组所用各种限制性内切酶、T4 DNA连接酶及反转录酶、RNasin,PCR反应系统(Taq DNA聚合酶、dNTP、10×PCR缓冲液及MgCl2), 购自Boehringer公司和华美生物工程公司。

  1.2 RNA提取 取新鲜手术切除标本剪成米粒大小,置玻璃匀浆器中,按文献[6]的方法提取总RNA。将其溶于适量DEPC处理的三蒸水中,以紫外分光光度计定量。取1 μg总RNA作为反转录模板。

  1.3 RT-PCR 在计算机辅助分析下,设计2个引物。P1为正链引物,序列为:GCGAATTCATGCCACCTCCAGAAACGCTAATGGACTCCAC,引入EcoR I酶切位点,加上3个脯氨酸以确保蛋白的正确折叠、伸展;和进行酵母双杂交的筛选;P2为负链引物,序列为:CCATTCTGGATGATGCGG。由P2引物引导合成cDNA,反转录反应系统包括:AMV(5U),RNasin(40U)和dNTP(500 μmol/L),于42℃反应1 h。反应结束后,于95℃煮沸5 min。取cDNA液 5 μL作为PCR模板,用Taq DNA聚合酶在体外扩增基因30次循环。

  1.4 PCR产物的克隆 将以p1,p2引物扩增的产物补平,经EcoR I酶切后,电泳回收。质粒DNA的制备、DNA重组及重组体导入宿主菌,均参照文献[7]的方法进行。以酶切法鉴定重组的阳性克隆。

  1.5 克隆片段的序列测定 由本室采用自动测序仪完成。

  2 结 果

  2.1 EphB2中Ig样区基因的扩增 以P1和P2引物,在25 μL PCR反应体系中进行30次循环。取10 μL电泳后,可见1条长570 bp的扩增产物,片断大小符合设计要求(图 1)。

图1 EphB2 Ig样区基因的扩增

  M:PCR marker;P1:扩增的基因片段

  2.2 重组体的构建、筛选和鉴定 将回收的570 bp片断补平后,用EcoR I酶切、乙醇沉淀,在T4连接酶作用下,与EcoRI和Sma I双酶切的pBluescript(-)质粒于14℃连接过夜。挑取4 个菌落快速抽提质粒进行酶切,均切下1条0.5 kb左右的DNA片段(图2),证实所筛选的重组质粒中已正确插入目的基因片段。

图2 重组质粒的酶切鉴定

  M: pGEM-7zf(Hae Ⅲ消化); 1,2,3,4:菌落和EcoR I及BamH

  I消化的质粒.

  2.3 EphB2 Ig样区基因序列的测定 阳性克隆经双链模板变性后,与M13正向通用引物退火结合,按PE公司的测序说明书进行全自动荧光法序列测定。测定结果(图3)与已知序列[3]的Ig样区相一致。

图3 EphB2 Ig样区基因的序列

  3 讨 论

  近年来,因参与神经系统细胞间的相互作用而倍受关注的Eph亚族(其命名[8]源自该亚族最早的成员Eph,即erythropoietinproducing human hepatoma cell line),是最大的RTK(receptor tyrosine kinase)亚族,由约15个基因组成。Eph亚族基因的区域化表达,与神经轴突束的组织趋化性和发育途径有对应关系。根据Eph亚族在胞外结构域上的同源性、表达分布及结合配体的不同,可将Eph 受体及其配体(ephrins)分为两个亚族:EphA类受体主要与ephrinA类配体结合,该类配体靠糖基磷脂酰肌醇链(GPIlinkage)锚定在膜上,而EphB 受体主要与跨膜配体(ephrinB)相结合 [9]。目前,由于该家族的信号转导通路和生理作用不断揭示,为最终阐明其功能奠定了基础。EphB2 cDNA全长为3118 bp,其开放读框编码978个氨基酸残基,氨基端还有不完全信号肽区域。其ephrinB 配体体外对毛细管的诱导与angiopoietin1(Ang1)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)的功效相类似,而内皮细胞与周围间充质细胞的相互作用需ephrin-B2 配体和 EphB2受体间的信号传导[10]。究竟EphB2及其配体在各种病理生理过程中,有什么特殊的作用?仍需采用各种手段研究。因此,该区基因克隆的完成,为寻找与之结合的细胞外信号分子,对了解EphB2的酪氨酸蛋白激酶的激活机制,以及如何进行细胞生长的信号传递开辟了道路。

  基金项目:国家自然科学基金资助,No.39800027

  作者简介:张晓光,女,31岁,讲师博士

  西安市长乐西路17号.Tel.(029)3374516-11

  参考文献:

  〔1〕 Fantl WJ, Johnson DE, Williams LT. Signaling by receptor tyrosine kinase〔J〕 . Annu Rev Biochem, 1993; 62:453- 487.

  〔2〕 Wang HU, Chen ZF,Anderson DJ.Molecular distinction and angiogenic interaction between embryonic arteries and veins revealed by ephrin B2 and its receptor Eph B4〔J〕 .Cell,1998;93(5):741- 745.

  〔3〕 Kiyokawa E, Takai S.Overexpression of ERK, an EPH family receptor protein tyrosine kinase,in various human tumors〔J〕 . Cancer Res, 1994; 54:3645- 3650.

  〔4〕 Juha PH, Mark H, Dimitar BN. Crystal structure of the ligand- binding domain of the receptor tyrosine kinase EphB2〔J〕 . Nature,1998; 396: 486.

  〔5〕 Hock B, Bohme B, Karn T,et al. PDZ domain mediated interaction of the Eph related receptor tyrosine kinase EphB3 and the ras binding protein AF6 depends on the kinase activity of the receptor〔J〕 . Proc Natl Acad Sci USA, 1998; 95(17): 9779- 9784.

  〔6〕 Chomzynski P, Sacchi N. Single step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate phenol chloroform extraction〔J〕 . Anal Biochem, 1987;162:156- 159.

  〔7〕 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning, a laboratory manual〔M〕 . 2nd Ed. Cold Spring Harbour laboratory. 1989:

  〔8〕 Unified nomenclature for Eph family receptors and their ligands, the ephrins. Eph Nomenclature Committee. Cell,1997; 90(3): 403- 404.

  〔9〕 Martin L, Andrew CO, Mirella D, et al. Distinct subdomains of the EphA3 receptor mediate ligand binding and receptor dimerization〔J〕 . J Biol Chem, 1998; 273(32): 20228- 20237.

  〔10〕 Adams RH,Wilkinson GA,Weiss C,et al. Roles of ephrinB ligands and EphB receptors in cardiovascular development: demarcation of arterial/venous domains,vascular morphogenesis,and spro uting angiogenesis〔J〕 . Genes Dev, 1999 ; 13(3):295- 306.

收稿日期:1999-03-30

  修回日期:1999-06-07


作者: 风清扬 2009-2-21
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