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EphB2受体N端Ig类似区基因的克隆和序列测定
细胞与分子免疫学杂志 2000年第1期第16卷 分子免疫学
作者:张晓光 董巨莹 茹晓荣 药立波 刘新平 苏成芝
单位:张晓光 董巨莹 茹晓荣 药立波 刘新平 苏(第四军医大学生物化学与分子生物学教研室,陕西西安710032)
关键词:EphB2;基因克隆;酪氨酸蛋白激酶受体;PCR
中图号:Q78 文献标识码:A
文章编号:1007-8738(2000)01-0027-28
Eph家族是最大的酪氨酸蛋白激酶受体家族[1],已有14个成员,在神经轴突导向、血管发生及肿瘤形成等方面具有重要的功能[2]。EphB2是1994年Kiyokawa 等[3]从构建的胃癌组织cDNA文库中,筛选出的EPH亚类中又一新基因,在各种肿瘤组织中的表达均高于相应正常组织数倍。EphB2和其跨膜配体ephrinB1(formerly ElkL/Lerk2)与神经轴突的发育路径有关。其胞外球状结构域的晶体结构表明,该区是与其配体结合的关键结构域,可折叠形成蛋卷(jellyroll)三明治的空间构型[4]。实验证明,EphB2的C端可与ras结合蛋白AF6的PDZ结构域结合,并在NIH 3T3 和 NG108 细胞中以配体依赖的方式磷酸化AF6[5]。但其作用机制和生理功能的研究尚有许多空白。我们设计、合成了引物,扩增出其胞外Ig类似区基因并克隆,为进行表达,寻找新的配体,揭示该基因参与的信号传递过程,和阐明其生物学功能奠定了基础。
1 材料和方法
1.1 材料 pBluescript(-)质粒和DH5α菌种均由本室保存。胃癌手术切除标本,由本校西京医院普通外科提供。DNA重组所用各种限制性内切酶、T4 DNA连接酶及反转录酶、RNasin,PCR反应系统(Taq DNA聚合酶、dNTP、10×PCR缓冲液及MgCl2), 购自Boehringer公司和华美生物工程公司。
1.2 RNA提取 取新鲜手术切除标本剪成米粒大小,置玻璃匀浆器中,按文献[6]的方法提取总RNA。将其溶于适量DEPC处理的三蒸水中,以紫外分光光度计定量。取1 μg总RNA作为反转录模板。
1.3 RT-PCR 在计算机辅助分析下,设计2个引物。P1为正链引物,序列为:GCGAATTCATGCCACCTCCAGAAACGCTAATGGACTCCAC,引入EcoR I酶切位点,加上3个脯氨酸以确保蛋白的正确折叠、伸展;和进行酵母双杂交的筛选;P2为负链引物,序列为:CCATTCTGGATGATGCGG。由P2引物引导合成cDNA,反转录反应系统包括:AMV(5U),RNasin(40U)和dNTP(500 μmol/L),于42℃反应1 h。反应结束后,于95℃煮沸5 min。取cDNA液 5 μL作为PCR模板,用Taq DNA聚合酶在体外扩增基因30次循环。
1.4 PCR产物的克隆 将以p1,p2引物扩增的产物补平,经EcoR I酶切后,电泳回收。质粒DNA的制备、DNA重组及重组体导入宿主菌,均参照文献[7]的方法进行。以酶切法鉴定重组的阳性克隆。
1.5 克隆片段的序列测定 由本室采用自动测序仪完成。
2 结 果
2.1 EphB2中Ig样区基因的扩增 以P1和P2引物,在25 μL PCR反应体系中进行30次循环。取10 μL电泳后,可见1条长570 bp的扩增产物,片断大小符合设计要求(图 1)。
图1 EphB2 Ig样区基因的扩增
M:PCR marker;P1:扩增的基因片段
2.2 重组体的构建、筛选和鉴定 将回收的570 bp片断补平后,用EcoR I酶切、乙醇沉淀,在T4连接酶作用下,与EcoRI和Sma I双酶切的pBluescript(-)质粒于14℃连接过夜。挑取4 个菌落快速抽提质粒进行酶切,均切下1条0.5 kb左右的DNA片段(图2),证实所筛选的重组质粒中已正确插入目的基因片段。
图2 重组质粒的酶切鉴定
M: pGEM-7zf(Hae Ⅲ消化); 1,2,3,4:菌落和EcoR I及BamH
I消化的质粒.
2.3 EphB2 Ig样区基因序列的测定 阳性克隆经双链模板变性后,与M13正向通用引物退火结合,按PE公司的测序说明书进行全自动荧光法序列测定。测定结果(图3)与已知序列[3]的Ig样区相一致。
图3 EphB2 Ig样区基因的序列
3 讨 论
近年来,因参与神经系统细胞间的相互作用而倍受关注的Eph亚族(其命名[8]源自该亚族最早的成员Eph,即erythropoietinproducing human hepatoma cell line),是最大的RTK(receptor tyrosine kinase)亚族,由约15个基因组成。Eph亚族基因的区域化表达,与神经轴突束的组织趋化性和发育途径有对应关系。根据Eph亚族在胞外结构域上的同源性、表达分布及结合配体的不同,可将Eph 受体及其配体(ephrins)分为两个亚族:EphA类受体主要与ephrinA类配体结合,该类配体靠糖基磷脂酰肌醇链(GPIlinkage)锚定在膜上,而EphB 受体主要与跨膜配体(ephrinB)相结合 [9]。目前,由于该家族的信号转导通路和生理作用不断揭示,为最终阐明其功能奠定了基础。EphB2 cDNA全长为3118 bp,其开放读框编码978个氨基酸残基,氨基端还有不完全信号肽区域。其ephrinB 配体体外对毛细管的诱导与angiopoietin1(Ang1)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)的功效相类似,而内皮细胞与周围间充质细胞的相互作用需ephrin-B2 配体和 EphB2受体间的信号传导[10]。究竟EphB2及其配体在各种病理生理过程中,有什么特殊的作用?仍需采用各种手段研究。因此,该区基因克隆的完成,为寻找与之结合的细胞外信号分子,对了解EphB2的酪氨酸蛋白激酶的激活机制,以及如何进行细胞生长的信号传递开辟了道路。
基金项目:国家自然科学基金资助,No.39800027
作者简介:张晓光,女,31岁,讲师博士
西安市长乐西路17号.Tel.(029)3374516-11
参考文献:
〔1〕 Fantl WJ, Johnson DE, Williams LT. Signaling by receptor tyrosine kinase〔J〕 . Annu Rev Biochem, 1993; 62:453- 487.
〔2〕 Wang HU, Chen ZF,Anderson DJ.Molecular distinction and angiogenic interaction between embryonic arteries and veins revealed by ephrin B2 and its receptor Eph B4〔J〕 .Cell,1998;93(5):741- 745.
〔3〕 Kiyokawa E, Takai S.Overexpression of ERK, an EPH family receptor protein tyrosine kinase,in various human tumors〔J〕 . Cancer Res, 1994; 54:3645- 3650.
〔4〕 Juha PH, Mark H, Dimitar BN. Crystal structure of the ligand- binding domain of the receptor tyrosine kinase EphB2〔J〕 . Nature,1998; 396: 486.
〔5〕 Hock B, Bohme B, Karn T,et al. PDZ domain mediated interaction of the Eph related receptor tyrosine kinase EphB3 and the ras binding protein AF6 depends on the kinase activity of the receptor〔J〕 . Proc Natl Acad Sci USA, 1998; 95(17): 9779- 9784.
〔6〕 Chomzynski P, Sacchi N. Single step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate phenol chloroform extraction〔J〕 . Anal Biochem, 1987;162:156- 159.
〔7〕 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning, a laboratory manual〔M〕 . 2nd Ed. Cold Spring Harbour laboratory. 1989:
〔8〕 Unified nomenclature for Eph family receptors and their ligands, the ephrins. Eph Nomenclature Committee. Cell,1997; 90(3): 403- 404.
〔9〕 Martin L, Andrew CO, Mirella D, et al. Distinct subdomains of the EphA3 receptor mediate ligand binding and receptor dimerization〔J〕 . J Biol Chem, 1998; 273(32): 20228- 20237.
〔10〕 Adams RH,Wilkinson GA,Weiss C,et al. Roles of ephrinB ligands and EphB receptors in cardiovascular development: demarcation of arterial/venous domains,vascular morphogenesis,and spro uting angiogenesis〔J〕 . Genes Dev, 1999 ; 13(3):295- 306.
收稿日期:1999-03-30
修回日期:1999-06-07