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hIL－16cDNA的克隆、测序及在E.coli中的表达与纯化研究
细胞与分子免疫学杂志 1999年第1期第0卷 论著
作者：杜勇 杜桂鑫 侯利华 汪涛 王海涛
单位：杜勇 杜桂鑫 侯利华 汪涛 王海涛（军事医学科学院微生物流行病研究所，北京100071）
关键词：白细胞介素－16；重组表达；蛋白纯化；大肠杆菌
摘要 在国内首次从人的外周血单个核细胞（PBMC）中克隆了人白细胞介素－16(hIL－16)cDNA,并应用一种新型的大肠杆菌表达系统─硫氧还蛋白表达系统，成功地表达了重组hIL－16。hIL－16cDNA的扩增：从人PBMC中提取总RNA，poly(T)8－12反转录cDNA,以半巢式PCR扩增出特异的DNA片段。hIL－16cDNA的克隆、测序与表达：利用E.coli表达载体pTrxFus,构建hIL16cDNA的重组质粒，转化E.coli后，经色氨酸诱导，表达出相对分子质量（Mr)为30000的可溶性融合蛋白，表达量占菌体蛋白的30％。序列测定证实，此片段长393bp,确为hIL－16cDNA。经一步渗透压休克，即获得了高纯度的表达蛋白。
中国图书资料分类号 R392.1
Cloning, expression and purification of human interleukin－16
Du Yong, Du Guixin, Hou Lihua,Wang Tao,Wang Haitao (Institute of Microbiology and Epidemiology, Beijing 100071)
Keywords interleukin－16 recombinant expression protein purification E.coli
Abstract The cDNA encoding human interleukin－16 was amplified by RT－PCR from total RNA of the peripheral blood mononuclear cells from hepatitis C virus carrier and a recombinant plasmid pTFIL－16 was constructed by cloning cDNA of IL－16 into E.coli expressing vertor pTrxFus(Invitrogen Co.).A soluble 1 hioredoxin－ hIL－16 fusion protein with relative molecular mass(Mr)30 000 was expressed in E.coli GI724 habouring plasmid pTFIL－16.The fusion protein accounts for 30％ of the total protein from the bacteria.The purified fusion protein was obtained from intact bacteria by osmotic shock. DNA sequencing proved the cloned cDNA of hIL－16 has very high homogenicity with other reports.
人白细胞介素－16（IL－16)是由CD8＋T细胞分泌的细胞因子〔1〕。与其它细胞因子或趋化生长因子不同、IL－16被单一的cDNA编码、成熟蛋白由130个氨基酸组成，基因位于15号染色体（15q26.1）。IL16除作为CD4＋分子的配体、参与信号传导外，还能诱发CD4＋T细胞由G0期向G1期转变〔2〕。最近又发现，IL－16能在转录水平上有效地抑制艾滋病毒的复制，而成为治疗艾滋病的潜在药物〔3，4〕。
国外已对IL－16的重组表达、性质及作用进行了较深入地研究，而国内至今尚未见有IL－16的研究报道。本实验用RT－PCR，从一名丙型肝炎病毒感染者的PBMC中，成功地克隆了IL－16基因，构建了重组表达质粒pTFLI－16,并进行了该质粒在大肠杆菌的表达与蛋白的纯化。
1 材料和方法
1.1 主要试剂 淋巴细胞分离液购自中国医学科学院血液研究所。Trizol Reagents(GibicoBRL)AMV(Promega)、TaqDNA聚合酶、内切酶KpnI(Prome-ga)、T4DNA连接酶（Promega）及M13mp18,均购自华美公司。质粒pTrxFus和菌株E.coli GI724,购自美国Invitrogen公司。
1.2 细胞RNA的提取与反转录 抽取一名HCV感染者静脉血100ml，以等量PBS稀释后，用淋巴细胞分离液进行密度梯度离心，收集单个核细胞。细胞沉淀中加入20ml Trizol Reagents,制成匀浆。总RNA的提取按说明书操作，测定所获RNA的A260和A280，计算RNA的纯度与产量。取30μg总RNA作为模板，用poly（T）8-12作为引物按常规方法进行反转录。
1.3 半巢式PCR扩增 按发表的IL-16cDNA序列,设计PCR引物，P1：5＇AGGGCAATGAGGTTCTTTCC3＇;P2：5＇ATGGTACCCATGCC（CT）GACCTCAA3＇；P3：5＇CTGGTACCTTTTAGGAGTCTCCAGCA3＇。其中P1和P3为外引物；P2和P3为内引物，其5＇端各加KpnI酶切位点和两个保护碱基。PCR的扩增条件为：94℃,5min;94℃,1min;55℃,1min;72℃,1min,共30个循环；72℃延伸10min。
1.4 重组表达质粒的构建 RT－PCR扩增产物经纯化、KpnI酶切和低熔点琼脂糖回收后，用T4DNA连接酶与用相同酶切并去磷酸化的质粒pTrxFus连接，转化E.coli GI724,PCR和酶切鉴定阳性重组子及DNA片段的插入方向。
1.5 蛋白的诱导表达与纯化 挑取单个菌落接种于RM培养基，30℃摇振（250r/min）培养至饱和。按1∶20接种于新鲜的诱导培养基，继续在30℃振摇培养到A550=0.5。加入色氨酸至终浓度为100mg/L,诱导培养5h，离心集菌。用休克溶液I（20mol/LTris－HCl,pH8.0,2.5mol/LEDTA，20％sucrose)悬浮菌体至A550=5.0，冰浴10min，再离心集菌。弃上清，沉淀中加入与溶液I等量的休克溶液II（20mol/LTrisHCl,pH8.0,2.5mol/LEDTA),冰浴10min,以12000g离心10min，收集上清。
1.6 DNA序列测定 将重组表达质粒上的插入DNA片段亚克隆到M13mp18中，制备重组单链DNA，用373A型自动测序仪测序。
2 结果
2.1 人PBMC总RNA的制备 从人PBMC中提取的总RNA，经紫外分光光度计测定，A260/A280比值为1.80,表明所制备的RNA纯度较高；琼脂糖凝胶电泳检查，总RNA未发生降解，提示其中的mRNA分子完整，保证了下一步基因扩增的成功。
2.2 IL－16cDNA的RT－PCR扩增 上述mRNA经poly(T)8－12反转录、半巢式PCR扩增，得到大小约400bp的DNA片段（图1），与对IL-16cDNA预期的大小一致。
图 1RT－PCR和重组质粒pTFIL－16的酶切结果
Fig 1 RT－PCR and restriction enzymetic digestion of recom binant plasmid pTFIL－16
1: pTFIL－16/Kpn I; 2: RT－PCR; M: λ DNA/Hind II
2.3 IL－16重组表达载体的构建 RT－PCR产物经纯化、KpnI酶切，与载体pTrxFus连接，转化E.coli GI724后，经载体PCR引物与IL－16引物扩增鉴定，获得DNA片段正向插入的阳性重组质粒（pTFIL-16)。此质粒可用KpnI切下约400bp的DNA片段（图1），与RT-PCR扩增产物的大小一致。
2.4 IL－16融合蛋白的可溶性表达与纯化 应用pTFIL－16质粒转化E.coli GI724后，经色氨酸诱导，表达出Mr为30000的蛋白，表达量占菌体蛋白的30％左右。此蛋白正好相当于IL-16与thioredoxin的Mr之和（17000＋13000）。诱导后的完整菌体经渗诱压休克，释放出表达蛋白（图2），表明融合蛋白在菌体内呈可溶性表达，为表达蛋白的纯化与活性鉴定提供了有利的条件。
图2表达蛋白的SDS-PAGE分析
Fig 2 SDS-PAGE analysis of fusion protein thioredoxin-IL-16 xpressed in E.coli 1: Thioredoxin-IL-16 purified by osmotic shock; 2: Lysate of E.coli GI724/pTFIL-16; 3: Lysate of E.coli GI724/pTrxFus; M: Relative molecular mass
2.5 IL－16序列的测定用内切酶KpnI将pTFIL－16质粒上的DNA插入片段切下后，亚克隆到载体M13mp18中。经DNA序列测定证实，本实验所克隆的DNA片段确为IL－16cDNA，长度为393bp，和预计的大小相同。与国外报道相比较，我们所克隆的IL－16cDNA的第6位碱基与pro－i116cDNA[5]相同，为胸腺嘧啶，而humchema c DNA〔6〕则为胞嘧啶；第174位碱基是胞嘧啶，其它基因则是胸腺嘧啶，但这两处变异并未影响所编码的氨基酸（图3）。克隆IL-16cDNA已被GenBank收录，接收号为AF053412。
a: pro-i116/AF053412/humchema
b:MPDLNSSTDSAASASAASDVSVESTAEATVCTVTLEKMSAGLGFSLEGGKGSLHGDKPLTINRIFKGAAS
EQSETVQPGDEILQLGGTAMQGLTRFEAWNIIKALPDGPVTIVIRRKSLQSKETTAAGDS
图3 hIL-16cDNA序列比较与编码氨基酸序列分析
Fig 3 Sequence comparision of hIL-16 cDNA(A)and amino acid sequence of hIL-16(B)
3 讨论
除CD8＋T细胞外，CD4＋T细胞、嗜酸性细胞、呼吸道上皮细胞，以及脑、胸腺、脾、胰等组织中，也有IL－16mRNA的表达，但只有CD8＋T细胞分泌的IL－16具有生物学活性。IL－16合成后，贮存于CD8＋T细胞胞浆内，在受到抗原、有丝分裂原、组胺或5－羟色胺的刺激后，即释放出来〔2〕。本研究用一名丙型肝炎病毒（HCV）感染者的PBMC提取RNA，即考虑到此PBMC长期受HCV的刺激，可能有高表达的IL－16mRNA，这将有利于目的基因的扩增。实验结果表明，虽然mRNA只占总RNA的1％－5％，但用总RNA作为反转录模板，经半巢式PCR，仍然顺利地扩增出了特异性的IL-16基因，提示HCV感染者的PBMC确有IL－16mRNA的高表达。
重组IL－16在pET等原核表达系统中，都以包涵体的形式存在，呈不可溶性表达，复性中由于蛋白的不正确折叠，而使IL－16的生物学活性受到影响。而本实验所选用的Invitrogen公司的高效、可溶性表达系统—Thio-Fusion Expression System,则优于上述表达系统：即表达质粒pTrxFus上，克隆有E.coli的硫氧还蛋白（thioredoxin,trxA)基因，当硫氧还蛋白与外源蛋白融合表达时，不仅表达量高，而且融合蛋白的可溶性大大增加。另外，用简单的渗透压休克（osmotic shock)或热处理（heattreatment),即可纯化表达的蛋白；用肠肽酶（ente rokinase)可以切割去硫氧还蛋白，而得到非融合的目的蛋白。实验结果显示，重组IL-16在此表达系统中，可溶性大大提高。经一步渗透压休克，在菌体未破的情况下，融合蛋白即可完整释放出来。SDSPAGE分析可见，释放的目的蛋白纯度较高，为进一步实验奠定了基础。
作者简介：杜勇，男,33岁，助理研究员，博士
北京市丰台区东大街20号，Tel.(010)66948563
参考文献
［1］Crulkshand W, Kornfeld H, Berman J, et al. Biological activity of interleukin－16. Nature, 1996; 382:501～502
［2］Center DM, Kornfeld H, Crulkshank W. Interleukin－16 and its function as a CD4 ligand. Immunol Today,1996; 17(10):476～481
［3］Maciaszek JW, Parada NA, Cruikshank WW. IL－16 represses HIV－1 promoter activity. J Immunol, 1997; 158(1):5～8
［4］Zhou P, Goldstein S, Devadas K, et al. Human CD4 cells transfected with IL-16 cDNA are resistant to HIV 1 infection: inhibition of mRNA expression. Nature Medcine, 1997; 3(6): 659～664
［5］Baier M, Bannert N, Werner A, et al. Molecular cloning, sequence, expression, and processing of the interleukin 16 precursor. PNAS, 1997; 94:5273～5277
［6］Cruikshank WW, Center DM, Nisar N, et al. Molecular and functional analysis of a lymphocyte chemoattractant factor: association of biologic function with CD4 expression.PNAS,1994; 91(11):5109～5113
(收稿 1998－07－10 修回 1998－08－14)