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人白细胞介素-3突变体的构建及在大肠杆菌中表达的研究
中国免疫学杂志 1999年第1期第15卷 分子与细胞免疫学
作者：王 燕 朱锡华 万 瑛 纪贤文 刘 昕
单位：第三军医大学分子生物学教研室，重庆630038
关键词：PCR定点突变；hIL-3；cDNA突变体；高水平表达；hIL-3突变体
中国图书分类号 R392.11
摘 要 目的：为了在大肠杆菌中高效表达hIL-3cDNA，获得hIL-3蛋白，拟对天然型hIL-3进行构建以获得新的突变体，同时进行了活性测定，以便深入了解hIL-3的结构与功能之间的关系。方法：利用PCR技术对天然型hIL-3 N末端第3位蛋氨酸(Met3)和C末端第17位蛋氨酸(Lys116)进行定点突变，获得突变体MhIL-3和MVhIL-3。结果：经Suger双脱氧法测序证实突变体 MhIL-3 cDNA,MVhIL-3 cDNA 的活性为6.9×104 U/ml，而天然型的是1.5×104 U/ml。天然型pSM53hNIL-3表达量占菌体总蛋白的7%，突变型pSM53MVhIL-3表达量占菌体总蛋白的16%。结论：人IL-3 cDNA可通过PCR技术进行定点突变，所获得的突变型pSM53 MVhIL-3活性比天然型pSM53hIL-3高3～4倍。
PCR site-directed mutagenesis of human IL-3 cDNA in vitro human IL-3 by PCR site-directed mutagenesis study
WANG Yan, ZHU Xi-Hua①,WAN Ying et al.
Third Military Medical College,Molecular Biology Department, Chongqing 630038.①Third Military Medical College,Molecular Immunology Department, Chongqing 630038
Abstract Objective: In order to obtain a high level express of human IL-3,we modified the human IL-3 cDNA with PCR based mutagenesis method. And also we have determined the new mutant variant human IL-3 cDNA structure and its protein products activity. This method can be used to study gene modification, the structure or function of protein and the relationship between themselves.Methods: The human IL-3 cDNA mutants were obtained by PCR in vitro. The codon Met3 and Lys116 in human IL-3 cDNA were substituted by codon (GTT) of Val. Nucleotide sequences of the PCR products were determined by DNA sequence.Natural human IL-3 cDNA (NhIL-3 cDNA) and mutant variant human IL-3 cDNA (MvhIL-3 cDNA) have been inserted downstream of promoter with a set of expression vectors, and transfered into E.Coli.Results: E.Coli bacterial cells boring the plasmid pSM53 NhIL-3 expressed only 7% protein of the total bacterial body protein but the pSM53 MhIL-3 cDNA had produced a high level of human IL-3 about 16% of the total bacterial body protein. The molecular weight of the product is 15 kD. Their biological activity respectively is 1.5×104 U/ml and 6.9×104 U/ml。Conclusion:The human IL-3 cDNA can be reconstucted with PCR mutagenesis method to get a new human IL-3 cDNA mutant. The activity of this MVhIL-3 expressed protein we have obtained is 3-4 times of the NhIL-3.
Key words PCR site-directed mutagenesis Human IL-3 cDNA gene modification High level expression hIL-3 mutant
人白细胞介素-3(Interleukin-3，hIL-3)是由活化的T细胞产生的一种细胞因子，可刺激造血干细胞的分化和成熟，并且对其他造血因子有协同增强作用。利用PCR技术对hIL-3 cDNA进行体外定点突变并在大肠杆菌中表达［1，2］。近年来国内外对IL-3的研究，天然的hIL-3 cDNA在大肠杆菌中很难获得高效表达。本研究利用PCR技术构建了hIL-3 cDNA突变体，利用已有的表达载体，在大肠杆菌中初步表达了hIL-3 cDNA突变体，获得hIL-3蛋白，同时进行了初步活性研究，对了解hIL-3的结构与功能之间关系奠定了一定的基础。
1 材料与方法
1.1 菌株与质粒 含有人IL-3 cDNA质粒pBVhIL-3 cDNA由本室构建，PUC18，PUC19质粒，大肠杆菌JM103均为本室保存。pSM53质粒，3 185 bp，氨苄青霉素抗性，TAP106 Leu,dio,thi,galam,lac U169 rpsL,supE44 λ｛［int ralⅠ ΔBamHI,cI857,I(ro bio)］｝由第四军医大学生物化学教研室陈苏民教授馈赠。
1.2 主要试剂 各种工具酶，限制性内切酶SmaⅠ，HindⅢ,EcoRⅠ,T4DNA Ligase,Klenow酶，dNTP，地高辛标记试剂盒和NC膜购自Boechriger Mannheim公司。T7测序盒购自Promega公司。α-32p-dATP购自北京亚辉生物技术公司。RPMI1640培养基，谷氨酰胺，小牛血清，购自GIBCO公司。 胰蛋白胨酵母提取物，MTT，GSSG，GSH，兔抗人IL-3多克隆抗体(效价1∶5 000)购自Sigma公司。标准蛋白分子量购自原平生物技术公司。hIL-3细胞依赖株：TF-1细胞购自中科院上海生化研究所。辣根过氧化酶标记羊抗兔IgG(效价1∶200)购自北京中山公司。
1.3 引物 4条引物序列：primer A 22 mer CTCCATGGCTCCCATGACCCAG,primer B 23 mer CGAAGCTTC-TAAAAGAGATCGCGAG,primer M 22 mer CTCCATGGCTCCCGTTACCCAG,primer V 20 mer GTAACCAGATAGAACGTCAG由上海细胞所合成。
1.4 目的基因的扩增
1.4.1 天然hIL-3基因的扩增 primer A与primer B分别为上游和下游引物，模板pBV hIL-3，PCR反应体系为100 μl,95℃变性10 min后加Tag酶0.5 U，然后按94℃，0.5 min；65℃ 0.5 min；72℃ 2 min进行28个循环，最后72℃，10 min。
1.4.2 突变hIL-3 cDNA的扩增 第3位Met突变为Val，以primer M为上游引物，primer B为下游引物。第3位Met和第116位Lys均突变为Val，经过2次PCR，第一次上游引物为primer M,下游引物为primer V,第二次PCR以第一次PCR扩增的产物为上游引物，称之为primer D,primer B为下游引物，其它反应条件同前。
1.5 PCR扩增产物序列分析 PCR扩增产物纯化、回收及与PUC18，PUC19质粒的连接、转化、筛选参照文献［3］。DNA序列分析按照Sanger法进行。Sequenase的使用参照Promega产品说明书。
1.6 hIL-3 cDNA在大肠杆菌中表达及活性测定 将hIL-3 cDNA克隆入表达载体pSM53中，并对重组子进行筛选，鉴定［3］。将含有hIL-3 cDNA阳性重组子转化到大肠杆菌TAP106中培养，诱导表达［3］。对诱导的菌液进行SDS-PAGE电泳及免疫印迹检测hIL-3蛋白［4］。按常规的方法提取包含体并对包含体进行变性和复性［5］，然后用TF-1细胞以MTT法测定待测上清液中的hIL-3的活性［6］。
2 结果
2.1 扩增突变引物的设计 设计合成了4条引物，primer A和primer B分别为人IL-3 cDNA 5′和3′的引物，扩增出的产物是人IL-3 cDNA，全长为414 bp，而primer M和primer V为2个突变引物，其中primer M是将人IL-3 cDNA第3位氨基酸Met密码子突变为Val密码子，碱基由ATG突变为GTT。突变引物primer V是将人IL-3 cDNA第116位氨基酸Lys密码子突变为Val密码子，碱基由AAA→GTT，全长为414 bp。
2.2 PCR扩增产物的序列分析 引物设计时分别在primer A与primer B 5′上设计了限制性内切酶点(为NcoⅠ,HindⅢ)，插入经SmaⅠ和HindⅢ双酶水解后的PUC18，PUC19质粒，用Sanger双脱氧法测序证实MhIL-3 cDNA第三位氨基酸Met，密码子由ATG→GTT突变为Val密码子；而MVhIL-3 cDNA第三位氨基酸Met和第116位氨基酸Lys密码子均变为GTT，如图1所示。
2.3 hIL-3 cDNA突变体表达载体构建及活性检测
2.3.1 hIL-3 cDNA与表达载体pSM53的构建及筛选 pSM53hIL-3的构建如图2，pSM53用EcoRⅠ酶切填平后，分别将NhIL-3，MhIL-3，MVhIL-3平端连接在pSM53 PL启动子下。将按图2流程构建的重组子转化到大肠杆菌TAP106中。将筛选出的正向阳性重组子进一步用NcoⅠ/HindⅢ双酶切鉴定均匀切出414 bp相应片段。
2.3.2 重组hIL-3 cDNA在大肠杆菌中表达蛋白的检测及活性测定 将按图2中流程构建的pSM53 NhIL-3(天然型)，pSM53 MVhIL-3(突变型)，pSM53 MhIL-3(突变型)以15% SDS-PAGE检测hIL-3蛋白，在15 kD处可见pSM53 NhIL-3，pSM53 MVhIL-3有明显的特异蛋白带，而pSM53 MhIL-3和pSM53载体对照及TAP106菌体对照无此带，如图3(A)所示，表达产物与IL-3的分子量相符，并主要以包含体的形式存在，天然型pSM53 NhIL-3蛋白表达量占菌体蛋白总量的7%，突变型的pSM53 MVhIL-3蛋白表达量与蛋白总量的16%。15 kD处可见的hIL-3表达带，免疫印迹结果如图3(B)所示，pSM53 NhIL-3和pSM53 MVhIL-3在15 kD处均显示hIL-3表达带，提示pSM53 NhIL-3和pSM53 MVhIL-3在15 kD处的蛋白带是hIL-3的蛋白分子。将天然型pSM53 NhIL-3与突变型pSM53 MhIL-3，pSM53 MVhIL-3在相同条件下培养诱导的包含体经变性，复性制备的粗纯化hIL-3待测上清与pSM53质粒，hIL-3标准品同时用TF-1细胞株进行体外测活。活性结果分别为pSM53 NhIL-3 1.5×104 U/ml；pSM53 MhIL-3 0.2×104 U/ml；pSM53 MVhIL-3 6.9×104 U/ml。pSM53 MVhIL-3活性比相同条件下表达的天然型pSM53 NhIL-3和突变型pSM53 MhIL-3提高了3～4倍。
图1 PCR扩增产物部分测序
Fig.1 Sequence of hIL-3 PCR production
Note:A.sequence of MhIL-3 cDNA;B.sequence of MVhIL-3 cDNA
图2 pSM53 hIL-3表达质粒的构建
Fig.2 Structure of pSM53 hIL-3 expression plasmid
图3 pSM53 hIL-3的表达
Fig.3 Expression of pSMhIL-3
Note:(A)SDS-PAGE.Lane1:protein molecular weight markers;Lane2:pSM53 plasmid;Lane3:pSM53 NhIL-3;Lane4:pSM MVhIL-3;Lane5:pSM53 MhIL-3.(B)Western blotting.Lane1:pSM53 NhIL-3;Lane2:pSMMVhIL-3
3 讨论
人IL-3成熟蛋白是由133个氨基酸组成的肽链，据文献报道，链内有4个α螺旋结构，其中第1个α螺旋和第4个α螺旋与IL-3生物学活性及与IL-3受体结合能力的高低可能有关［7］，本文利用PCR技术对人IL-3 cDNA进行定点突变，结果表明十分有效，简便而且迅速。我们将PCR循环数控制在28个循环，测序结果表明没有因为Tag DNA聚合酶的错误复制引起的非预期突变。NhIL-3 cDNA与天然的hIL-3 cDNA序列完全一致，MhIL-3 cDNA，MVhIL-3 cDNA的结果与预期突变的结果一致。这说明当目的DNA序列不是很长，同时严格优化PCR反应的各种条件，是可以得到理想的点突变的结果。这一方法的建立使我们可以在基因的任一位置引入点突变，只需经两次PCR，可以得到我们需要的突变体DNA，从而对基因的修饰，蛋白质工程的研究提供了简便、稳定的方法。因hIL-3自身结构，IL-3很难以非融合型蛋白在大肠杆菌中高效表达。本室应用遗传工程技术构建了pBV220 hIL-3表达质粒，但在大肠杆菌中未见表达。在此基础上将人IL-3N末端第3位蛋氨酸(Met3)突变成缬氨酸(Val3)，C末端第17位赖氨酸(Lys116)突变成缬氨酸(Val116)，在大肠杆菌表达系统中表达了hIL-3突变体(pSM53 MVhIL-3)。突变型pSM53 MVhIL-3表达量明显高于天然型pSM53 NhIL-3，其活性也高于后者。研究表明，除非hIL-3N端融合一些细菌蛋白成分，否则hIL-3难以在大肠杆菌中高效表达［8］。本文采用非融合型表达载体对hIL-3进行表达，但天然型NIL-3与突变型MhIL-3表达量及活性不高，这可能与IL-3本身结构有关。将hIL-3的第3位氨基酸Met3和第116位氨基酸Lys116用Val所取代后，即突变体MVhIL-3其表达产量及活性均明显提高了3～4倍。提示hIL-3蛋白C末端的空间结构对其hIL-3活性有影响。
朱锡华 第三军医大学分子免疫学教研室，重庆630038
作者简介：王 燕，女，35岁，分子免疫学专业博士；
指导教师，朱锡华，男，教授，博士生导师，主要研究分子免疫学
4 参考文献
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〔收稿1997-07-15 三次修回1998-04-30〕