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食物过敏原检测及其应用前景

来源:网络
摘要:其中对食物的不良反应备受人们关注,大约30%的成年人在一生中至少有1次以上对食物不良反应的经历,20%~65%的过敏性肠道综合征和消化不良患者的病因与食物过敏有关。目前惟一有效的治疗方法是避免食用过敏的食物,而检测患者对何种食物过敏就显得尤为重要。食物过敏原的研究是检测试剂研发,过敏机制研究的重要基础,......

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过敏性疾病影响全世界近四分之一的人口,被世界卫生组织列为21世纪重点防治的三大疾病之一。其中对食物的不良反应备受人们关注,大约30%的成年人在一生中至少有1次以上对食物不良反应的经历,20%~65%的过敏性肠道综合征和消化不良患者的病因与食物过敏有关。目前惟一有效的治疗方法是避免食用过敏的食物,而检测患者对何种食物过敏就显得尤为重要。食物过敏原的研究是检测试剂研发,过敏机制研究的重要基础,现对当前食物过敏原的检测方法及常见过敏原的研究进展综述如下。

一、食物过敏原的检测方法

(一)双盲食物激发试验

双盲食物激发试验(double-blind,placebo-controlledfoodchallenge,DBPCFC)为诊断食物过敏的金标准,主要用于以下情况:
 
(1)几种食物同时被怀疑为过敏原且特异性IgE(specific IgE,sIgE)阳性,为减少患者禁食种类时可使用;(2)高度怀疑某一过敏物,但无sIgE抗体的证据,为进一步确定进食该食物的安全性时使用;(3)非IgE介导型食物过敏者多用该方法。患者应先进行排除饮食,然后施以食物刺激,在操作过程中为控制偏倚,可不让患者知道进食食物的种类或使用安慰剂,但对反应较严重的IgE阳性的过敏原。不宜做该试验。由于该试验有一定危险性,且近年来有证据表明定量IrE检测可预测DBPCFC的试验结果,结合临床病史多数食物过敏可得到确诊,故真正需进行DBPCFC的患者并不多。

(二)皮肤针刺试验(skinpricktest,SPT)

SPT为临床常用的检测过敏原特异性IrE的体内试验。具体方法为用稀释抗原液点刺皮肤,同时进行阴、阳性对照,15min后观察检测点是否出现风团或潮红反应,如风团直径超过阴性对照3 mm则为阳性,表明存在与过敏原IgE结合的肥大细胞。SPT最显著的优点是价格便宜,快速,而且可让有疑心的患者看到结果;但许多因素如季节,测试时间,待测区域,药物等都会影响其结果,且所用的蔬菜、水果等过敏原提取物缺乏稳定的蛋白,故该法的重现性较差。同时,不同地区及医院所检测的过敏原种类、浓度、判别标准及质控措施有很大差别,这使医院间共用结果受到限制。

(三)体外8IgE检测

与体内试验相比,体外检测具有效能参数可靠,不受药物影响,无全身反应危险等优点,在下列情况下首选:(1)对过敏原极度敏感;(2)皮肤异常;(3)患者服用干扰皮肤反应的药物;(4)患者不合作或拒绝皮肤检测;(5)患者处于严重过敏反应后由于巨细胞介质耗尽所致的不应期。近年来,体外sIgE检测技术有了很大的发展。

1.放射过敏原吸附试验(radio allergosorbent test,RAST):RAST为最早使用的过敏原检测方法。其主要原理是将过敏原结合到固定相,加入待测血清及参考对照,血清内存在的过敏原-slgE将吸附在固定相上,通过用放射性同位素标记的抗IrE二抗来检测血清中的8IgE。由于该法费用昂贵,花费时间长,放射性同位素易过期且污染环境,不同来源试剂盒的参比血清不同而不易相互比较,待检血清含有相同特异性IgG时可干扰正常结果,故目前已逐渐被测定帽(CAP)过敏原检测法所代替。

2.测定帽(CAP)过敏原检测系统是目前国际上广泛应用并公认较为可靠的过敏原定量体外检测系统,主要原理为酶联免疫荧光测定法(fluorescent enzyme immunoassays,FEIA)。CAP系统建立于新型固体相——装在小胶囊中的亲水性载体聚合物上,由一种经溴化氰活化的纤维素衍生物合成,与过敏原有极高的结合能力。其过程为将50标准血清或患者血清加入到固有相,再将酶标抗IgE二抗加入到固有相中,最后测定荧光并与标准曲线比较。CAP过敏原检测法测定范围为0.35~100KU^/L(A:allergen sIgE),变异系数(CV)<10%。通常以sIgE>0.35KU^/L为临界点(即阳性反应),其阴性预报正确率达95%,敏感性也高达94%~100%,但其特异性较差,阳性预报正确率(positive predictive values,PPV)则更低。若根据情况调整临界点,则可提高其特异性和PPV。该系统可分析常见的6种食物过敏原:鸡蛋、牛奶、花生、大豆、小麦和鱼。

3.进口试剂和方法:目前,有许多快速检测sIgE的商用试剂盒,如德国MEDIWISS公司生产的Allergy Screen系统,该系统为半定量免疫印迹试验,检测板中的硝酸纤维素膜上包被有过敏原,依次加入250血清、生物素标记的抗人IrE抗体和碱性磷酸酶标记的链霉亲和素,最后经BCIP/NBT底物显色,检测板上相应的过敏原条带处将会出现红色,颜色的深浅与血清中sire含量成正比。检测板经Rapid阅读仪摄像和配套软件分析,将结果分为0~6级,>2级为阳性结果,该法可同时检测十几种食物过敏原及总IrE,特异性及敏感性较好。再如美国ASI公司生产的过敏反应体外检测系统(简称IVT法),由1只反应管组成,反应管中含有一系列塑料段,在这些塑料段的表面包被有单一过敏原、过敏原混合物或单克隆抗体。患者血清中的sIgE抗体可以与他们分别反应,形成免疫复合物后沉淀下来,随后加入酶及底物,根据颜色反应判断阴、阳性,该法特异性较好,但耗时较长。另外,许多全自动免疫分析仪都配有相应的过敏原检测试剂盒,如美国梅里埃的Stallertest检测系统,s0hn等试验证明该系统与UNICAP有很好的相关性,再如ALK-Abello开发的ADVIACentaur免疫分析系统,其敏感性及特异性与UNICAP相似,且具有用血量少,快速出报告,无IgG干扰等优点,但这些方法的仪器试剂都很昂贵。

4.生物芯片:近年来,渐趋成熟的蛋白质芯片技术因其高通量、微型化、平行性检测等优点,正越来越多的应用于药物筛选、肿瘤标志筛查J、临床检测等领域,被看作是最有前景的诊断工具。Fall等将抗原液固化于活化显微玻璃上,用化学发光系统检测slgE,与Pharmacia CAPFEIA等方法比较,该法重现性及灵敏性较好,用血量仅为25l,且检测时间为1h以内。Wohrl等用微芯片技术检测过敏原也取得了类似的结果。Matsuya等用实时分辨荧光微芯片检测过敏原sIgE,与CAP/BASTFEIA比较有很好的相关性。尽管近年来蛋白芯片检测过敏原有了很大发展,但有几个问题仍需解决:(1)玻璃基质本身的缺陷、芯片表面微尘的聚集及去湿化使蛋白芯片极易产生人为信号,而这些干扰信号是操作者不能简单识别的,因此,必须建立严格的标准以评估结果;(2)蛋白芯片点样不准确,批问差异较大,这还需通过点样技术的提高来克服。

(四)生物共振技术

目前,生物共振技术在食物过敏原检测中的应用受到越来越广泛的关注。该技术的基石是法国科学家DeBroglie的物质波理论,根据该理论,每种物质都会产生特有的物质波即共振波,此共振信息可被采集、放大、削弱。过敏是一种生物物理信息现象,该现象在人体内产生需要过敏印痕的出现,这种过敏印痕来源于物质与人体的多次接触,然后逐渐产生基于物质信息的生物物理印痕,一旦人体产生了这种印痕信息,它就可能被维持并处于休眠状态,当再次接触过敏源时印痕被激活,并进而通过生物物理脉冲诱发常见的变态反应疾病。每种过敏印痕的信息是此种过敏原惟一的生物物理共振模式,使用共振技术可将致敏信号检测出来。德国BICOM2000型生物共振过敏原检测治疗系统就是以此原理运作的。该系统可检测上百种食物过敏原,有特殊情况的病人可自带可疑过敏原进行检测。该技术检测过敏原的特点是无创、快速、检测范围广,无创伤性,极易在儿童中推广。但该技术对食物过敏诊断的意义,其科学性、合理性等还有待证实,其特异性、敏感性、重复性等还值得进一步探讨。

二、常见食物过敏原的研究进展

因各种过敏原检测试剂都用到重组或提取的过敏原且过敏原在过敏性疾病的治疗中起重要作用,故对过敏原进行研究具有重要意义。食物过敏原一般为相对分子质量10000~70000的蛋白质或糖蛋白,可分为主要过敏原与次要过敏原,大多数过敏患者对主要过敏原敏感。

(一)甲壳类动物及其产品

随着海产品受到越来越多人的青睐,这类食物过敏反应的报道也逐渐增多。其中,虾过敏原备受关注,据报道0.6%~2.8%的过敏性疾病患者对虾过敏。人们在虾肉中检测出至少13种IgE结合蛋白,但原肌球蛋白被鉴定为惟一的主要过敏原,相对分子质量介于34000~39000之间。据报道,原肌球蛋白是虾、蟹、牡蛎、乌贼等无脊椎动物的重要抗原,具有高度保守的氨基酸序列。

(二)蛋类及其产品

鸡蛋是儿童食物过敏反应最常见的原因之一,其阳性率在儿童食物过敏中达35%,而成人过敏也高达12%。蛋白的主要过敏原为卵类黏蛋白Galdl(相对分子质量为28000)、卵白蛋白Gald2(相对分子质量为44000)、卵传铁蛋白Gald3(相对分子质量为77000)和溶菌酶Gald4(相对分子质量为14000);蛋黄的主要过敏原为Ot卵黄蛋白(相对分子质量为70000)。据报道,鸡蛋过敏中,蛋白比蛋黄更易引起过敏,卵类黏蛋白为主要过敏原。

(三)牛奶与奶制品

小于2岁的儿童牛奶过敏率为1.6%~2.8%,50%~9o%的儿童在6岁前转为耐受。牛奶主要过敏原为酪蛋白(Bosd8,相对分子质量为20000~30000)、B哥L球蛋白(Bosd5,相对分子质量为18000)、Ot.乳白蛋白(Bosd4,相对分子质量为14000)、牛血清白蛋白(Bosd6,相对分子质量为67000)和牛免疫球蛋白,其中酪蛋白的免疫原性与抗原性最强。牛奶抗原相对稳定,在常规处理后可保持其免疫原性。

(四)花生及其产品

由于花生过敏反应的严重性及高发性,该过敏原引起医疗机构的广泛关注。据报道食物诱导的过敏反应中,花生过敏占10%~47%。主要花生过敏原为Arah1(相对分子质量为63500),Arah2(相对分子质量为17000),其他相关抗原有Arah3(相对分子质量为60000),Arah4(相对分子质量为14000)。次要抗原有Arah6、Arah7及肌动蛋白。经ELISA抑制试验证实Arah2是引起花生与榛子、杏仁等交叉反应的主要抗原。不同的食物处理方式对花生抗原有不同影响,据报道烘烤会提高Amhl的含量,且使IgE抗体结合表位更易与抗体结合。虽然花生与豆科植物有交叉反应蛋白,临床交叉反应却不多见。花生过敏多见于对蛋、奶、核桃等过敏的个体,但并未发现其与核桃有交叉反应性蛋白。多数情况下,花生过敏终生存在且可恶化。近年来,免疫电泳、ELISA、PCR、生物传感器等多种技术被应用于食物过敏原的研究,使人们对食物过敏原的认识有了很大进步,但食物过敏原的交叉反应性,不同处理过程对其过敏原性的影响以及转基因食物的过敏原性等问题还须进一步探索。

综上所述,近年来,食物过敏的发病率有上升的趋势,而过敏原的检测对疾病的预防、治疗意义重大。随着免疫学的发展,食物过敏原的检测技术有了很大的进步,但也存在着不足:(1)因食物过敏原为(糖)蛋白,这类(糖)蛋白有些稳定,有些不稳定,使试验的敏感性受到限制;(2)一些坚果类食物、海鲜存在交叉反应,故食物过敏原检测特异性不是很强口;今后还有待进一步改善。检测食物性过敏原的还有血IGG检测,组胺释放试验,嗜碱性粒细胞活化试验等方法,没有哪种方法能检测出所有的食物过敏原,故临床实践中应注意联合应用。

分子生物学与免疫学的发展使人们对食物过敏原的结构、免疫原性等有了进一步的认识,而生物信息学的发展为过敏原的研究提供了强有力的支持,在分析过敏原结构,识别T淋巴细胞与B淋巴细胞表位,评估过敏原性与交叉反应性等方面与传统实验室技术互补。现在国外已有一些网站可以评估食物蛋白的交叉反应性,并可根据转基因食物的基因序列来评估其过敏原性。相信在不久的将来,人类会对食物过敏原有更深刻的认识,这为今后食物过敏机制的研究、过敏原检测试剂的研发都提供了很好的平台。


作者: 未知 2009-2-21
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