白细胞介素-2的研究进展及应用

随着分子生物学、免疫学理论和技术的发展，运用重组表达技术来生产预防和治疗疾病的制品已成为近几年研究的热点。白细胞介素-2是一种具有广泛生物学活性的细胞因子，它能够有效地提高免疫功能，医学上已用于预防和治疗一些常规方法难以治疗的疾病，如肿瘤等；在兽医方面因其能提高疫苗的免疫效果，尤其是在基因工程亚单位苗的免疫效果而倍受重视，展现出广阔的应用前景。
　　一、白细胞介素-2的受体及其生物学功能：
　　白细胞介素-2(IL-2)是一种最早发现的具有广泛生物活性的细胞因子，在1979年第二届国际淋巴因子会议上正式命名，它必须和IL-2受体结合才能发挥生物学效应。1981年，Robb等发现T细胞表面存在IL-2受体。IL-2R是由3个糖蛋白亚基组成的，分别为α，β，γ链，分子量为55kD，75kD和64kD，故又称p55，p75和p64。单个亚基不能传递IL-2信号，只有2或3个亚基组成复合体方能发挥受体功能。依据与IL-2亲和力的大小，可将IL-2R分为3类，中、高亲和力受体分别由。αβ和αβγ链组成，能传导IL-2介导的细胞增殖和细胞溶解信息；低亲和力受体由α链组成，不能传导IL-2介导的信息。IL-2Rγ是IL—4、IL—7、IL—15、IL—9等多种细胞因子受体的功能性组成单位；参与多种免疫学功能的调控。鸡IL-2也有与哺乳动物IL—2相似的受体。IL—2通过与表达IL—2R的细胞表面的IL—2R结合发挥生物学活性。
　　二、IL-2的种属特异性：
　　大量交叉实验表明，IL—2的种属特异性是有一定规律的，一般呈下行性，即进化程度高的动物的IL-2可以作用于进化程度较低的动物。如人和猿的IL-2。几乎可以作用于所有哺乳动物的，细胞；但其它哺乳动物的IL-2很少可以作用于人：在进化程度相当的动物中，也显示明显的种属特异性，哺乳动物IL-2之间有交叉性，如牛IL-2可以作用于水牛和山羊，但活性仅有35％，对IL-2的氨基酸分析表明，这与其受体结合部位氨基酸序列较保守有关，另外，氨基酸排列顺序和形成的空间构型也有很大关系。
　　人和其它哺乳动物的IL-2不作用于家禽，原因是禽与哺乳动物种间隔离较大。在IL-2体外诱生实验中；禽与哺乳动物细胞培养条件不同，细胞密度、培养时间、温度、丝裂原的量都有不同。禽脾细胞加ConA和2％同种鸡血清诱导20h后，分泌类似人IL-2的因子，能使ConA活性的鸡T—cell生长，未活化的不能生长。鸡CM(条件培养基)不支持ConA活化的人、鼠淋巴细胞，人、鼠CM也不支持鸡ConA活化淋巴细胞。家禽细胞因子与人和哺乳动物的同源性极低，如鸡IFN基因与哺乳动物I型IFN核苷酸同源性最高只有43％，氨基酸同源性最高只有24％。
　　三、白细胞介素-2的cDNA克隆：
　　1985年鼠IL-2cDNA，首先克隆成功。建立活化的鼠T细胞系cDNA文库。建库所用载体含有SV40早期启动子，转染COS—7细胞后，使插入片段高效表达，表达后检测细胞培养上清液的IL-2活性，筛选出3个具有IL-2活性的cDNA克隆。
　　人IL—2(hIL—2)克隆成功于1986年。用ConA诱导人的白血病T细胞系Jurkat—111分泌IL—2，然后提取mRNA注入蛙卵进行体外翻译，建立cDNA文库，再将重组质粒DNA转移到硝酸纤维膜上，用mRNA与之杂交，回收吸附于膜上的mRNA，再进行体外翻译，从而克隆了第一个hIL-2cDNA。
　　同年，牛IL-2(bIL-2)cDNA克隆成功；建立活化牛淋巴细胞cDNA文库后，用hIL—2cDNA探针进行筛选。成熟IL—2含有135个氨基酸，分子量为15.42kD，与人和鼠的IL-2各有65％及50％的同源性。
　　李祥瑞于1995年用真核表达系统成功克隆了鸡IL-2；并获得高活性重组鸡IL-2。采用SPF鸡脾脏T细胞，体外诱生IL-2，经生物学活性检测确认细胞培养上清中具有IL-2的生物学活性，提取诱导过的脾单核细胞的总mRAN，反转录合成cDNA，将核酸片段与质粒载体连接，质粒转化宿主菌DH10B，建立cDNA文库。所用质粒载体为穿梭质粒pSV·SPORTI，它既能在大肠杆菌内增殖，又带有SV40，复制原点及早期启动子，能在COS-7细胞中瞬时表达，表达产物经生物学活性检测，证明其有IL-2活性，经过两轮筛选，共获得14个阳性克隆。经序列分析表明，鸡IL-2与人和其它哺乳动物IL-2cDNA同源性在50％左右。
　　四、鸡IL-2的纯化及生化特性：
　　Shnetzler等首先将由外周血淋巴细胞诱生的IL-2用40％-80％硫酸铵沉淀后，用SephadexG-100凝胶层析，IL-2活性峰以PBS透析，以Blue-sepharose胶层析后进行SDS-PAGE电泳。结果2个活性峰分子量分别为9.0-11．5kD和19．5-21．5kD，后者可能是前者的双聚体。Vainio等用此方法得到分子量为13kD的分子，用等电聚焦估计鸡IL-2的PI为5．9。
　　Fredericksen和Sharma将由脾淋巴细胞诱生的IL-2超滤浓缩，浓缩物通过Phenyl-sepharose柱，未吸附蛋白进一步用阴离子交换剂柱层析，再以Superose-12柱进行高效层析。结果得到2个活性峰，分子量分别为26．0kD和14．0kD，经SDS-PAGE电泳第一峰形成分子量的30．0kD的带，第二峰可能因蛋白含量太低而无带形成。同时发现鸡IL-2亲水性低，与鼠IL-2的高亲水性不同，可用Phenyl-sepharose柱纯化。
　　Myers等报道了利用5步法纯化鸡IL-2的结果：(1)超滤缩，(2)硫酸铵沉淀，(3)SephadroseG—100凝胶过滤层析；(4)反相高压液相层析，(5)Phenyl—sepharose层析。SephfidexG-100层析后得到2个活性峰，SDS—PAGE电泳后分子量分别为17．5—25．0kD和36．0-39．0kD。高分子量峰经解聚烷基化后再以SephasexG—100层析，得到一分子量为17．5kD的峰，说明鸡IL—2可以形成聚合体或与其他蛋白质聚合。
　　五、IL-2的应用：
　　1.作为免疫治疗剂。Weinberg报道，多次使用IL—2可以明显降低实验性感染豚鼠生殖系统单纯疱疹病毒感染的复发率；Tellz等报道，使用鸡ConA活化T细胞诱导产生的细胞因子，可以使鸡肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)器官侵入率降低51％-60％；此种细胞因子注入鸡胚，同样可以降低孵化期鸡胚的沙门氏菌器官侵入率。Quiroga等报道，将重组牛IL—2注入牛乳房，可以明显降低细菌性乳房炎的发病率。
　　2．构建新型基因工程苗。Ramshaw等、Flexner等先后报道将小鼠或人IL—2cDNA与含禽流感血凝素(HA)基因的痘病毒重组，获得表达IL-2的重组病毒。将这种重组病毒与不含IL—2基因的痘病毒同时接种裸鼠；结果显示，IL—2的插入并不影响HA的表达水平及免疫原性，但可以防治对裸鼠的致死。说明插入细胞因子可以大大提高活病毒载体的安全性。Hazama等将IL—2基因与牛单纯性疱疹病毒糖蛋白D基因融合，真核细胞内表达融合蛋白；免疫小鼠后攻毒。结果该融合蛋白可以完全保护小鼠免疫病毒攻击，而以氢氧化铝为佐剂但不含IL—2的重组糖蛋白只产生部分保护，IL—2在体内的半衰期也因此延长大约4倍。表明采用此种方式获得IL—2抗原重组蛋白，是研制新一代基因工程苗的另一途径。
　　3.作为免疫增强剂。目前亚单位苗是疫苗研究的热点，但亚单位苗只能对寄生虫产生部分保护力，许多兽医工作者把注意力集中到亚单位苗所需的免疫增强剂(Immunopotentiator)上。重组细胞因子能明显提高细菌、病毒和寄生虫疫苗的免疫效果。细胞因子免疫增强剂不同于以往的化学佐剂，它们能调节动物对疫苗的反应，包括免疫细胞向接种部位移动，抗原提呈，促进Th细胞的产生，B细胞的成熟和分化，激活包括NK细胞、嗜酸性细胞和肥大细胞在内的非特异性杀伤细胞。重组人IL—2能提高伤寒杆菌活苗和荚膜多糖亚单位苗的免疫效果，重组牛IL—2与牛疱疹病毒I型活苗一起使用；血清中牛和抗体滴度比单独使用疫苗组提高6倍。用牛疱疹病毒糖蛋白亚单位苗免疫牛，并注射IL—2，可显著提高特异性抗体滴度，特异性细胞毒反应和特异性淋巴细胞增殖反应。重组牛IL-1、IL—2能促进牛病毒性腹泻死苗的免疫效果。IL—2分别于狂犬病疫苗或疟疾疫苗联合使用，对相应抗原的攻击有保护作用。