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第一部份：时间分辨的原理、我国乙肝两对半的流行情况及时间分辨在乙肝两 对半上 的应用技术
一、时间分辨荧光分析（ Time-resolved Fluorescence Immunoassay TRFIA ）的基本原理。
TRFIA 是用三价稀土离子及其螯合剂作为示踪物，如 铕 （ Eu3+ ）、 铽 （ Te3+ ）及钐（ Sm3+ ）、 镝 （ De3+ ）等代替传统的荧光物质、放射性同位素、酶和化学发光物质，来标记抗体、抗原、多肽、激素、核酸探针或生物活性细胞，待反应体系（如抗原抗体免疫反应、生物素（链）亲和素反应、核酸探针杂交反应、靶细胞与效应细胞的杀伤反应等）发生后，用时间分辨荧光仪测定最后产物中的荧光强度，根据荧光强度和相对荧光强度比值，判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目的。
运用稀土离子及其螯合剂作为标记物，被激发的荧光有以下特点：
1、与普通的荧光比较，稀土离子螯合物荧光的衰变时间长，为传统荧光的 103 ～ 106 倍。从而可以通过延缓测量时间，让短寿命荧光衰变掉后，再测量目标样品，这样可以最大限度地克服来自样品、试剂的自然本底短寿命荧光（通常为 120nS ）及散射光的干扰，大大提高检测的灵敏度。
2、激发光与发射光的 Stokes 位移大，可以达到 200 多 nm ，而普通荧光物质的 Stokes 位移最多也只有几十纳米。这表明，在某一波长测定样品荧光时，可以通过非常简单的方法（如使用滤波片或分光计），就可消除激发光和散射光的干扰；同时，被激发的荧光光带极窄，荧光的发射 峰非常 尖锐，可使仪器调整在极窄的波长范围内测定，极大地降低了来自背景的各种干扰。
3、标记物为原子标记，体积很小，标记后不会影响被标记物的空间立体结构，这既保证了被检物质的稳定性（尤其对蛋白质影响更小），又可实现多位点标记。标记物稳定，就可以对标记物进行多次激发，通过对每次激发的荧光信号累加后（如激发测量 1000 次）取平均值的办法，可以大大减少偶然误差的产生，提高检测的准确度；同时多位点标记技术，不仅使检测更灵敏，也可使用双标记技术使一个试剂盒能够同时检测出两种或两种以上的项目。
TRFIA 技术集酶标记、同位素标记技术的优点于一身，具有灵敏度高、特异性强、稳定性好、标记物制备简便、储存时间长、无放射性污染、检测重复性好、操作流程短、标准曲线范围宽和应用范围广泛等优点，成为继放射免疫分析之后，标记免疫分析法发展的一个新的里程碑，被称之为 " 零本底 " />
除上述常见模式外，还存在一些非常规模式，包括 HBsAg 与 HBsAb 同时存在的模式。 ( 只在现在 HbsAg 1 μ g / L 以下的人群中 ) 推测二者同存的原因可能是 HBV 发生变异引起 [2] ；近年来亦有发现 HBeAg 可以与 HBeAb 共存的模式，在慢性乙型肝炎伴活动期肝损伤时，几乎 100% 为 HbeAg 、 HBeAb 共存。因之，对乙肝血清标志物的测定对临床有着极其重要的价值。
近年来医学临床和预防的要求对低水平存在的血清学标志物进行有效检测，具有更重要的临床和流行病学意义。研究证实，在部分 HBV 感染的人群中，血清表面抗原呈低水平存在，容易造成漏检。尤其是目前普遍采用的酶标检测方法，对低水平人群更容易造成漏检。在较大范围的非肝炎患者住院人群的检测结果表明，血清 HBsAg 约在 5 μ g/L 以下者占总人群的 2.34% ；占 HBsAg 阳性人群的 23.16% ，其中， HBsAg 浓度在 1 μ g/L 以下的占多数（ 44.40% ） [2] 。多方面研究表明，低水平血清 HBsAg 人群占有不小的比例，尤其我国是乙肝的高发区，加之人口众多，此类人群不容忽视。由于检查方法上的不灵敏，还可导致乙肝病毒通过手术，输血等途径发生传播等严重后果。因此，进一步提高血清 HBsAg 检测的灵敏度有重要意义。
三、时间分辨技术定量检测乙肝两对半的重大意义
运用 TRFIA 对乙肝五项进行定量 检测极 大地弥补了酶标法定性检测的不足，成为乙型肝炎血清学标志 物现代 临床检验的发展方向，新波公司为此研制了 HBV 的 TRFIA 试剂盒，并获得国家批准文号，这是一个可喜的成果，它将推动我国乙肝防治工作和进展，同时亦将推动 TRFIA 技术的普遍应用。 TRFIA 在 HBV 感染诊断及免疫力监测方面的定量检测具有如下优越性：
◇ 极大地提高了检测的灵敏度
时间分辨荧光免疫定量技术（ TRFIA ）检测 HbsAg 灵敏度可达 0.2ng/ml, 而酶标（ EIASA ）检测的灵敏度是 2ng/ml ，极大地提高检测的灵敏度。因此，在急性乙肝早期能及早检出 HbsAg ，确证 HBV 感染，缩短窗口期；其次，可发现低浓度 HbsAg 携带者；在部分慢性乙肝患者中，由于机体缺乏对 HBV 包膜蛋白的免疫应答， HbsAg 表达较低，酶标检测可出现 HbsAg 和 HbsAb 均阴性的情况， TRF 技术则可避免这些情况的发生，为正确判断病情提供依据。
◇ 能动态观察疗效和监测病情
1 ）定量分析 HBsAg 和 HBsAb 的浓度变化，可预见急性乙肝是否处于恢复期。如 HBsAg 浓度降低， HBsAb 浓度逐渐升高，可说明病情正往恢复期发展；反之， HBsAg 浓度处于较高水平或上升趋势，而 HBsAb 一直处于较低水平，则易发展为慢性乙肝或病毒携带者。
2 ）定量分析 HBeAg 和 HBeAb 的浓度变化，可反映病情变化和治疗效果。定量测定能明确检测 HBeAg 向 HBeAb 转换的时期，即表现为 HBeAg 浓度下降和 HbeAb 升高的过程。高浓度的 HBeAg 还可间接提示病毒处于高复制状态，具有较高的传染性。高浓度的 HBeAb 一方面提示病情好转，而在某些时候（如肝功能指标很差）则可能与肝坏死、肝硬化、肝癌有关。
3 ）HBcAb 浓度的高低可反映病毒感染的状态。高浓度的抗 - Hbc 提示乙肝急性感染，恢复期浓度降低。慢性 乙肝呈抗 - Hbc 持续高浓度。而低浓度的抗 - Hbc 一般为恢复期或既往感染。
4 ）有利于对慢性肝炎活动性或非活动性的判断。非活动性慢性乙肝各项指标相对稳定，活动性往往呈现进行性变化。
◇ TRFIA 和定量 PCR 技术可互相补充
血清 HBV-DNA 荧光定量 PCR 测定可以直接反映血液中病毒复制状态，具有很多临床应用价值，但不能完全反映病毒复制静息期肝细胞内 HBV 病毒状态。 HBV-DNA 阴性并不完全代表体内 HBV 已被清除，结合 " 两对半 " 各项指标更能客观反映体内 HBV 病毒状态。
◇ HbsAb 的定量测定能够对乙肝的预防起到监督作用
HbsAb 的定量测定能够对抗体是否真正具有 " 中和 "HBV 的免疫力作出正确评价，对乙肝的预防起到监督作用。 HbsAb 的含量在 10mlU/ml 以上病人 ELISA 检测即可呈阳性结果，但并不提示机体都一定具有免疫力，而 HBsAb 的含量在 10-100mlU/ml 之间的样本，定性虽为 " 阳性 " />