丙型肝炎病毒包膜蛋白E2人源单链可变区抗体的筛选与鉴定

1材料和方法 
　　1.1 材料 HCV E2抗原购于美国Virostat公司，系基因工程有达纯化的重组蛋白。人源化噬菌体抗体文库为轻链可变区和重链可变区经甘氨酸接头(Gly_4Ser)₃连接的抗体文库。辅助噬菌体M13K07购于Pharmacia公司，Wizard质粒DNA提取纯化试剂盒购于Promega公司。其他试剂均为国产分析纯。
　　1.2 特异性HCV E2噬菌体人源单链可变区抗体的筛选 首先将噬菌体抗体库扩增活化，用辅助噬菌体M13K07侵染后37℃培养12小时，浓缩噬菌体。用HCV E2抗原(20mg/L)包被Nunc培养板，包被液为0.05M NaHCO3,pH9.6缓冲液，以小牛血清白蛋白(BSA)37℃封闭2小时后加入浓缩的噬菌体，室温90分钟，作PBST和PBS各快速洗涤20次，以0.1M三乙胺洗脱已吸附在平皿上的噬菌体，然后用1M Tris(pH7.4)中和，再感染对数生长期的大肠杆菌受体菌TG1，培养扩增使表达HCV E2特异性ScFv的噬菌粒得到富集。继续重复3次上述：吸附、洗脱、扩增"过程。
　　1.3噬菌体单链可变区抗体阳性克隆的鉴定 将最后一轮筛选得到的重组菌涂平皿，从中挑选56株单克隆菌株，置于2×TY(氨苄青霉素100mg/L)中，37℃培养过夜。加入辅助噬菌体M13K07侵染后，30℃培养过夜。上清液用于酶联免疫吸附法(ELISA)检测。对筛选得到的阳性克隆重复ELISA检测过程。由于纯化的HCV E2蛋白保存于含有BSA中，因而从理论上来讲有可能筛选到BSA特异性和噬菌体单链可变区抗体。因此又以BSA作为包被抗原，结合与BSA的交叉反应情况，确定6株与BSA交叉反应较弱的阳性克隆进行竞争抑制实验，最后选定一个阳性克隆提取质粒，进行DNA序列测定。
　　1.4 阳性克隆株DNA序列测定 对筛选得到的阳性克隆菌株按照Wizard质粒DNA纯化试剂盒方法提取质粒，采用双脱氧末端终止法，由北京赛百盛生物工程公司(ABI377型自动测序仪)进行DNA序列测定。
　　2.结果 
　　2.1 噬菌体单链可变区抗体库的筛选 以重组HCV E2作为固相化的抗原，对噬菌体单链可变区抗体库进行3轮"吸附-洗脱-扩增"的筛选。单链可变区抗体特异性噬菌粒的富集结果见表1。随着淘洗次数的增加，从固相平板洗脱下来的噬菌粒数显示了明显的增加趋势，在第3轮筛选后结合到包被HCV E2抗原皿的噬菌体与第一轮相比，富集了96倍。(富集倍数=第3轮产出率/第1轮产出率)。
　　2.2 对HCV E2噬菌体单链可变区抗体的鉴定 从第三轮筛选后得到的细菌集落中随机挑选56个克隆，用ELISA方法测定上清液中含有的噬菌体单链可变区抗体与HCV E2抗原结合活性。其中有16株ELISA的吸光度(A)值较高。对这些噬菌体抗体进行与BSA的交叉反应试验后，确定其中有6株交叉反应较弱，结合2次ELISA重复试验的A值，最后确定6株阳性克隆。其ELISA吸光度的测定结果如图1所示。
　　2.3 HCV E2特异性ScFv阳性克隆株DNA序列测定 对筛选得到的阳性克隆选定竞争抑制率为52%的一个菌株提取质粒，进行DNA序列测定，DNA大小为750bp，符合单链抗体大小特征。HCV E2特异性ScFv编码基因的核苷酸和编码产物的序列如图2所示。
　　3.讨论 
　　　　　　　　　表1 亲和吸附筛选对噬菌体抗体的富集　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Tab.1 Enrichment of phagemid by biopanning technique

筛选次数	噬菌粒数	产出率/总的噬菌体粒数
	投入　　　　　　　　　捕获
第1轮 　　　　　　　　　　2.0×1013 　　　　　2.0×108 　　　　　　1.0×10-5
第2轮 　　　　　　　　　　2.0×1013 　　　　　2.4×109　　　　　　 1.2×10-4
第3轮 　　　　　　　　　　2.5×1012　　　　　　 2.4×109　　　　　　 0.96×10-3

　　产出率=洗脱的噬菌体数量/所用的噬菌体数量

ATG GCC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG CCT GGG GCC
M 　　A 　Q 　V 　Q　　L 　V 　Q 　S　G 　　A 　E　V　　K　K 　　P　G　　A
TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCT 　TCT GGA TAC　ACC TTC ACT AGC TAT GCT ATG
S　　V　　K　　V　S　　C　K　　A 　　S　　G　Y 　　T　　F　T 　S　　Y　　A　M
CAT TGG GTG CGC CAG GCC CCC GGA CAA AGG CTT GAG TGG ATG GGA TGG ATC AAC
H 　　W　V　　R　　Q　A　　P　　G　Q　　R　　L　E　　W　M　　G　　W　I 　N
GCT GGC AAT GGT AAC ACA AAA TAT TCA CAG AAG TTC CAG GGC AGA GTC ACC ATT
A　　G　　N　　G　N　　T　K　　Y　　S　Q　　K　　F　Q　　G　R　　V　T 　I
ACC AGG GAC ACA TCC GCG AGC ACA GCC TAC ATG GAG CTG AGC AGC CTG AGA TCT
T 　　R　D　　T　　S　A　　S　　T　A　　Y 　M 　E 　L　　S　S　　L　　R　S
GAA GAC ACG GCC GTG TAT TAC TGT GCA AGA TCG AGT GGG CCG ATG CAT CGT GAG
E 　　D　T　　A 　V 　Y 　Y 　C 　　A　R　　S　S 　G　　P　　M　T　　G　　G 　　　　GGC CAA GGT ACC CTG GTC ACC GTG TCG AGA GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA
W 　　G　Q 　　G　T　　L　V 　　T　V　　S　　R　G　G　　G 　G　　S 　G
GGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA TCG TCT GAG CTG ACT CAG GAC CCT GCT GTG TCT
G 　　G　　S　G　　G　G　　G　　S　S 　E 　L 　　T 　Q 　D　P　　A　V　　S
GTG GCC TTG GGA CAG ACA GTC AGG ATC ACA TGC　CAA GGA GAC AGC CTC AGA AGC
V 　　A 　L　　G　Q 　T 　V　　R 　I 　T 　C 　　Q　G 　D 　S　　L 　R 　S
TAT TAT GCA AGC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA CAG GCC CCT GTA CTT GTC ATC
Y　　Y　　A　S 　　W　Y　　Q　　Q 　K　P　　G　Q　　A　　P　V　　L　　V　I
TAT GGT AAA AAC AAC CGG CCC TCA GGG ATC CCA GAC CGA TTC TCT GGC TCC AGC
Y 　　G　K　　N　　N　R　　P　　S　G　　I　P　　D　　R　F　　S　G　　S 　S
TCA GGA AAC ACA GCT TCC TTG ACC ATC ACT GGG GCT CAG GCG GAA GAT GAG GCT
S　　G 　N　　T　　A　S　　L　　T　I　　T　G　　A　　Q　A　　E　　D 　E 　A
GAC TAT TAC TGT AAC TCC CGG GAC AGC AGT GGT AAC CAT GTG GTA TTC GGC GGA
D 　　Y　　Y　C　　N　　S　R　　D　S　　S　G　　N　　H　V　　V　F　　G　　G
GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGT GCG GCC GCA GAA CAA AAA CTC ATC TCA GAA
G　　T　　K　　L　T　　V　　L　G　　A　A　　A　　E 　Q 　K 　L　　I　S 　E
GAG GAT CTG AAT GGG GCC GCA TAG
E 　　D 　L　　N　G　　A　　A　*
　　　　　　图2 丙型肝炎病毒包膜蛋白E2特异性ScFv的基因序列及编码产物

　　Fig2 Nucleic acid and amino acid sequences of ScFv for HCV E2 protein

　HCV E2蛋白是HCV基因组编码的一种重要的结构蛋白质。在抗HCV保护性疫苗研究中，一般认为E2的HVR1区具有重要的中和表位。而HVR1又是变异最大的区，其诱导产生的抗体往往是病毒株/型特异性的，因此研制保护性疫苗非常困难。许多学者发现，一种抗HVR1与不同的HVR1变异株有一定的交叉反应。又有学者以200多个HVR1序列为基础，构建噬菌体展示文库，筛出的模拟表位(mimotope)能诱导产生与大量HCV变异病毒株有交叉反应的抗体。由此看来，发展多种HCV E2混合抗体可能对大多数HCV变异株产生中和作用。但是，通过杂交瘤技术生产人-人单克隆抗体十分困难，人源化噬菌体抗体库能在体外通过相应筛选噬菌体而获得的特异性的人单克隆抗体，解决了杂交瘤技术不易生产人单克隆抗体的问题。我们以HCV E2重组蛋白包被为固相抗原在第3轮筛选后，使结合HCV E2的噬菌粒富集了96倍。实验表明从噬菌体抗体库中筛选出的HCV E2人源单克隆抗体，具有较强的结合活性，且该方法具有简便、快速、经济等特点，避免了利用杂交瘤技术制备该抗体周期长、尤其是存在鼠源性蛋白反应的问题。ELISA和免疫组织化学技术鉴定，筛选得到的HCV E2单链可变区抗体具有较高的抗原结合活性和较好的特异性。
　　蛋白酶的抑制剂在抗人免疫缺陷病毒1(HIV-1)感染的治疗中具有十分重要的作用和地位。因而人们推测通过寻找HCV病毒蛋白特异性的小分子抗体，可能是探索抗HCV新型治疗方法的重要途径。在我们的工作中，利用噬菌体抗体库技术已经得到HCV NS3，NS5，C区，NS4A的人源单链可变区抗体。通过逆转录病毒载体和腺病毒载体，可以将这些单链可变区抗体的编码基因导入到细胞中进行抗HCV的细胞内免疫的基因治疗。关于HCV单链可变区抗体介导的细胞内免疫基因治疗的抗HCV治疗新方案正在探索之中。