有限稀释定量PCR检测血清HBVDNA的临床应用及意义

　　材料与方法

　　一、临床资料

　　1997年3月～6月间住院病人，ELSIA检测HBV血清学标志HBsAg和HBeAg双阳性患者38例，以美国先灵葆雅公司生产的重组干扰素(IFNα-2b)300万U肌肉注射，每周3次，分别于治疗前后留取血清，-20℃保存，待检HBV DNA浓度。

　　二、试剂

　　(一)检测HBV标志的ELISA试剂盒 购自上海科华实业生物技术公司，操作方法和结果判定，参照说明书。

　　(二)HBVDNAPCR引物 +5’-TCCC TAT GGG AGTGGG CC-3’(637-654bp)及-5’-TTA GGG TTT AAA TGTATA CCC-3(844-824bp)为本所合成，扩增片段长度208bp；Tag酶及dNTP购自原平生物技术公司。DNA分子量标准PBR322／Hinf I Marker购自医科院基础所生物技术开发公司。

　　(三)HBV DNA定量参照品 本所HBVC区克隆酶切产物，紫外分光光度计标定HBV DNA含量为25ng／ml。

　　三、方法

　　(一)血清HBV DNA的提取 取血清50μl加等量裂解液，60℃温育30min，加等量苯酚混匀，12 000r／min离心5min，取上清加等量氯仿：异戊醇(24：1)混匀，再同上离心、氯仿抽提，取上清加2倍体积无水乙醇沉淀DNA，15 000r／min离心15min，弃上清，75％乙醇洗两次，室温干燥后50μl去离子水溶解。……