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γ/δT cells′ expression in autoimmune diseases.
ZHANG Wen,ZHANG Naizheng,CHEN Weizheng.
（Department of Rheumatology,Chinese Academy of Medical Science.Peking Union Medical College Hospital,Beijing 100730,China.）
【Abstract】 Objective To make clear the expression of γ/δT cells in peripheral blood in different autoimmune diseases.Methods The total γ/δ T cells,V γ1 and V γ9/Vδ 2 subsets were examined in peripheral blood of 12 normal controls,24 systemic lupus erythematosus (SLE) patients,12 primary Sjgren′s syndrome (pSS) patients,14 rheumatoid arthritis (RA) patients and 10 Behcet′s disease (BD) patients by using cytometry assay.Results It was shown that only in patients with active SLE,the number of γ/δ T cells were remarkably decreased.Unlike active SLE,the γ/δ T cells in stable SLE and pSS patiens showed no significant differences in comparison with the normal controls.In RA and BD patients,the total number of γ/δ T cells and/or Vγ9/Vδ2 subset number increased in peripheral blood.Conclusion These results suggest that γ/δ T cells do play a role in autoimmune diseases and they probably play different roles in different connective tissue diseases.
【Key words】 Receptors,antigen,T-cell,gamma-delta; Autoimmune diseases; T-lymphocyte subsets
自身免疫性疾病往往病因不清，患者体内存在多种多样的免疫异常，近些年的研究已证实，患者MHC、补体及α/βT细胞受体均参与系统性红斑狼疮(SLE)等病的免疫发病机制。γ/δT细胞是近10多年来认识到的一种新的T细胞亚群，它与α/βT细胞有一些相似的特点，但还具有许多独特的特征，如分布与α/βT细胞不同，在皮肤、肠上皮、肺、生殖道和脾窦部位分布较多；基因多样性较α/βT细胞少，基因重排较α/βT细胞有限；识别的抗原有所不同，除多肽类外还识别磷配基和醇类抗原，其中热休克蛋白(HSP)是最主要的抗原。与抗原反应时常是MHC非依赖性的［1］；具有自然杀伤细胞(NK)和淋巴因子活化杀伤细胞(LAK)的活性等。因此，在多种免疫反应中，γ/δT细胞和α/βT细胞起着相互补充的作用。随着对该细胞认识的加深，人们逐渐开始研究该细胞与自身免疫病之间的关系，该细胞在发病机制方面的作用等等［2］。已发现γ/δT细胞在自身免疫病发病和致病中均起一定的作用，但其机制还远远没研究清楚。本研究通过用带有藻红素(PE)或荧光素(FITC)的单克隆抗体标记γ/δTCR后进行流式细胞仪分析而了解几种常见自身免疫病(SLE、RA、pSS、白塞病)外周血中γ/δT细胞的表达情况，由于外周血中以表达Vγ1和Vδ2的细胞占γ/δT细胞的90%以上，故本实验选择总γ/δT细胞和这两个细胞亚群进行研究。
1 资料与方法
1.1 病例选择：SLE患者共24例。均符合1982年美国风湿病学会制定的SLE诊断标准，其中依据SLE活动指数LACC(the lupus activity cuiteria count)诊断为活动期者12例，男女比例为2∶10，平均年龄(32±12)岁；稳定期患者12例，男女比例为1∶11，平均年龄(30±7)岁；类风湿关节炎(RA)患者14例，符合1987年美国风湿病学会修订RA分类标准，其中男性2例，平均年龄(38±9)岁；原发性干燥综合征(pSS)12例，符合pSS诊断标准，不合并其他自身免疫病，其中男性1例，平均年龄(41±12)岁；白塞病患者10例，符合国际白塞病研究组提出的白塞病诊断标准，其中男性6例，平均年龄(34±12)岁；另设正常对照12名，男女比例5∶7，平均年龄(31±6)岁。
1.2 实验步骤：每例患者或正常对照各4管，分别为：阴性对照、CD3-FITC/Vγ1-PE、CD3-FITC/总γ/δ-PE及Vγ9-FITC/Vδ2-PE。
取全血100 μl分别加入纯化的鼠抗人单克隆抗体Vγ1、总γ/δ和Vδ2各5 μl；阴性对照不加；摇匀，使抗体与细胞表面充分结合，室温下静置15 min；每管加入4 ml PBS，洗涤，1 500 r/min 8 min离心，弃上清；再加入带有藻红素(PE)的羊抗鼠单克隆抗体溶液各61 μl (PBS 50 μl＋正常人血清10 μl＋羊抗鼠单抗－PE 1 μl)；阴性对照不加；摇匀，使抗体充分结合；室温下静置15 min；PBS 4 ml洗涤，1 500 r/min离心8 min，弃上清；再加入小鼠血清5 μl，摇匀，室温下静置8 min；加入带有荧光素(FITC)的鼠抗人单抗(CD3或Vγ9)各5 μl；摇匀，使充分结合。室温下静置15 min；加溶血液各2 ml，静置15 min，1 500 r/min离心8 min，弃上清；每管加PBS洗涤，1 500 r/min离心8 min，弃上清；加1%PBS甲醛固定细胞。待流式细胞仪检测分析。
流式细胞仪分析：首先选择所需的细胞群(淋巴细胞)，然后计数细胞约5 000个左右，得到阴性、单染PE、单染FITC和双染的4个细胞群，t检验分析结果。
2 结 果
几种疾病患者外周血中γ/δT细胞及亚群的表达，见表1。
2.1 SLE：活动期SLE患者总γ/δT细胞、Vγ1亚群及Vγ9/Vδ2亚群在淋巴细胞中所占比例均比正常对照减少。而上述3组细胞在T细胞(CD3＋)中的比例却与正常对照差异无显著性。故γ/δT细胞亚群在SLE活动期的减少是与总T细胞减少成正比的。稳定期SLE患者上述3种γ/δT细胞在淋巴细胞和T细胞中所占比例与正常对照差异无显著性。故稳定期SLE患者的γ/δT细胞数目正常。
2.2 RA：RA患者总γ/δT细胞和Vγ9/Vδ2亚群在淋巴细胞和T细胞中所占比例均比正常对照增高。Vγ9/Vδ2与总γ/δT细胞的比值与正常差异无显著性，故Vγ9/Vδ2亚群与总γ/δT细胞成比例增多。
2.3 pSS：pSS患者γ/δT细胞在淋巴细胞和T细胞中所占比例与正常对照差异均无显著性。故pSS患者的γ/δT细胞数量无明显改变。
2.4 白塞病：白塞病患者总γ/δT细胞、Vγ1亚群在淋巴细胞和T细胞中所占比例与正常对照差异无显著性。Vγ9/Vδ2亚群在淋巴细胞中所占比例及在总γ/δT细胞中的比例较正常对照明显增高。故Vγ9/Vδ2亚群T细胞在白塞病中选择性增多。
表1 几种自身免疫病患者外周血中γ/δT细胞表达情况(
| 组别 | 占淋巴细胞中的比例 | 占T淋巴细胞中的比例 | 占总γ/δ的比例 | ||||
| Vγ1 | 总γ/δ | Vγ9/Vδ2 | Vγ1 | Vγ9/Vδ2 | 总γ/δ | Vγ9/Vδ2 | |
| 正常对照 | 14.3±1.23 | 5.88±3.97 | 3.20±2.99 | 1.49±1.46 | 5.79±5.53 | 7.24±4.49 | 51.18±22.93 |
| SLE活动期 | 0.33±0.26* | 1.21±0.90* | 0.64±0.60* | 0.69±0.56 | 3.48±1.28 | 5.20±4.39 | 42.93±29.79 |
| SLE稳定期 | 1.63±1.42 | 4.27±3.15 | 1.47±1.26 | 2.67±2.53 | 3.67±3.35 | 7.98±5.73 | 51.55±19.69 |
| RA | 1.40±1.47 | 10.66±6.37 | 7.54±5.80 | 2.33±2.31 | 11.35±7.78 | 15.75±8.60 | 67.76±21.95 |
| pSS | 1.90±1.95 | 5.93±4.12 | 3.05±2.67 | 3.52±3.28 | 5.01±4.13 | 9.70±6.64 | 38.62±27.13 |
| 白塞病 | 1.40±1.43 | 8.76±6.41 | 7.13±5.23* | 2.48±2.28 | 10.35±6.18* | 12.16±8.09 | 81.32±4.92* |
| 注：与正常对照比较，P＜0.05 | |||||||
3 讨 论
γ/δT细胞在人类免疫系统中的作用目前仍不很清楚，但许多研究已证实，该细胞的确参与自身免疫病的发病［3］。文献中报告在RA的滑膜、炎性肠病的肠黏膜、硬皮病的皮肤以及SLE、pSS、成人Still病和白塞病的外周血中γ/δT细胞数目及亚群都有改变，且部分疾病γ/δTCR基因呈单克隆或寡克隆表达。一些学者认为γ/δT细胞被超抗原成分或热休克蛋白活化后，一系列免疫反应导致的炎症过程或与自身抗原的交叉反应有关，γ/δT细胞分泌细胞因子，增强或抑制免疫球蛋白产生以及非特异性的杀伤功能等又进一步影响这些疾病的病理过程。
有关γ/δT细胞在SLE中作用的研究已有报告，但所得结果相差甚远，有时甚至是相反的。Lunardi等分析35例SLE患者和36名正常对照的外周血T细胞，结果SLE患者γ/δT细胞较正常减少，且γ/δT细胞与总T细胞的比例下降，以Vδ2阳性的亚群下降最明显。上述结果提示SLE患者除存在总T细胞下降外，还选择性的γ/δT细胞下降［4］。目前认为，γ/δT细胞在SLE中可能具有启动和调节自身免疫病理过程的双重功能，主要是为调节(抑制)α/βT细胞的作用，且有保护肾脏不受损伤的作用，某些亚群可以MHC非限制性方式杀伤活化的、有合成Ig能力的B细胞，使得其产生dsDNA明显受到抑制，dsDNA水平下降。本研究经流式细胞仪检测SLE患者外周血中γ/δT细胞及主要亚群表达情况表明，活动期SLE患者总γ/δT细胞，Vγ1亚群及Vγ9/Vδ2亚群在淋巴细胞中所占比例均比正常对照减少，且与总T细胞减少成正比；稳定期SLE患者总γ/δT细胞、Vγ1亚群及Vγ9/Vδ2亚群细胞数目正常。说明该细胞在SLE的自身免疫反应中起一定作用，与病情活动性呈负相关，可能为保护机制，推测某种因素导致该细胞数目下降，从而对α/βT细胞的抑制减弱。SLE活动性加强。
RA炎症关节的滑液中的γ/δT细胞以表达Vδ1和Vδ2的亚群为主，Vδ2＋细胞同时表达CD69＋、CD45RO＋等活化标志［5］。Hassan等发现病情较重的RA患者外周血中γ/δT细胞表达较病情轻的明显高，所以，他们认为γ/δT细胞扩增可能是RA恶化后的一个潜在因素［6］。RA滑膜分离出的γ/δT细胞均可表达GM-CSF、TNF-α、IL-10以及TGF-β，仅少数表达IL- 6和IL-8。因此，在RA滑膜中γ/δT细胞以Th1为主，主要起致炎作用，也有一定的修复作用［7］。另有实验表明可能存在某些细菌或结缔组织成分直接活化γ/δT细胞，导致关节破坏，而某些被特异性活化的T细胞持续在炎症滑膜中存在使得炎症转为慢性。本研究中14例RA患者外周血中总γ/δT细胞、Vγ9/Vδ2亚群在淋巴细胞中的比例明显升高，且以Vγ9/Vδ2亚群增生为主，占总γ/δT细胞的67.8%，结果与国外研究相似。因此Vγ9/Vδ2亚群在RA发病中起一定的作用，参与了RA的发病和免疫反应。如进一步对RA患者滑膜和滑液中γ/δT细胞及亚群的表达和活性标志进行分析，更能说明该细胞是致炎反应为主或是免疫调节为主。
在以前的一些研究中，对pSS患者外周血中淋巴细胞亚群的表达与正常人进行了比较，发现许多患者循环血中带有活化标志的γ/δT细胞增加［8］。然而，在pSS受累的外分泌腺中，如泪腺和腮腺组织中浸润的T细胞绝大多数都是α/βT细胞，未见某一亚群γ/δ的突出表达。Gerli等也发现尽管部分pSS患者外周血γ/δT细胞表达增多，但这些细胞多数表达非活化、记忆的标志，而非IL-2R、MHC-Ⅱ类分子等活化标志。本研究12例pSS患者外周血中无论总γ/δT细胞还是Vγ9/Vδ2和Vγ1亚群在淋巴细胞或T淋巴细胞中的比例与正常对照比较均无统计学差异，由此结果很难断定γ/δT细胞与pSS发病有关，然而，如再进行一些有关该细胞和亚群活化标志以及受累组织中γ/δT细胞的检测或许更有意义。
本研究白塞病患者外周血中虽然总γ/δT细胞与正常比较差异无显著性，然而表达Vγ9/Vδ2的亚群却选择性增高，占γ/δT细胞总数的81.3%，故该亚群可能是参与本病发病和病理损害的炎症细胞之一，推测可能某种抗原感染后使该亚群活化、增生而导致本病。国外研究也发现无论白塞病病情是否活动，患者的Vγ9/Vδ2＋ CD45RA＋ CD45RO－的γ/δT细胞明显增加，此型γ/δT细胞在病情活动阶段还表达IL-2R和HLA-DR，并产生相当数量的TNF和含穿孔素(perforatin)的颗粒，提示在白塞病活动时该细胞被活化，进一步使嗜中性粒细胞功能亢进，参加本病的免疫过程，导致炎症反应。
γ/δT细胞在自身免疫性疾病中出现数量的增多或减少，表型和亚群的分布与正常不同，以及产生细胞因子，抑制Ig产生等等，说明γ/δT细胞在自身免疫病发病中起着一定作用。本研究结果表明，γ/δT细胞参与了自身免疫病的发病，而不同病中所起的作用可能也不尽相同。
参 考 文 献
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2，Holoshitz J.Potential role of γ/δT cells in autoimmune disease.Res Immunol,1990,141:651.
3，Raulet DH.The structure,function and molecular genetics of the γ/δT cell receptor.Ann Rev Immunol,1987,7:175-207.
4，Lunardi C,Marguerie C,Bowness P,et al.Deduction in T γ/δT cell numbers and alteration in subset distribution in systemic lupus erythematosus.Clin Exp Immunol,1991,86:203-206.
5，Brennan FM,Jackson LAM,Hercend T,et al.T cells expressing γ/δ chain receptors in rheumatoid arthritis.J Autoimmune,1988,1:319.
6，Hassan J,Yanni G,Hegarty V,et al.Increased numbers of CD5＋ B cells and T cell receptor (TCR) gamma delta＋T cells are associated with younger age of onset in RA.Clin Exp Immunol,1996,103:353-356.
7，Gattorno M,Facchetti P,Ghiotto F,et al.Synovial fluid T cell clones from oligoarthcular juvenile arthritis patients display a prevalent Th1/Th0-type pattern of cytokine secretion irrespective of immunophenotype.Clin Exp Immunol,1997,109:4-11.
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