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Relation between shared epitope of HLA-DR antigen β chain and rheumatoid arthritis
LIU Qiaohong,TENG Yun,SHEN Lingxun
(Department of Rheumatology,Union Hospital,Tongji Medical University,Wuhan 430022,China)
【Abstract】 Objective To explore the association between expression of HLA-DR antigen shared epitope (SE) and rheumatoid arthritis (RA) in Han nationality in Wuhan of China.Method The method of DNA amplification with sequence-specific primers (PCR-SSP) was used to dertermine HLA-DRB101,04 genotype in 78 patients with RA and 126 healthy controls in Han nationality from Wuhan.Results There was a significant increase in the presence of amino acid sequence QKRAA of QRRAA both in RA patients overall compared with healthy group (43.6% vs 15.1%，P0.01).RA patients with SE were more severe in tender joint numbers,radiological severity and extraarticular disease than those with SE negative.Conclusion The results suggest that strong association between SE of HLA-DR antigen and susceptibility and severity to RA in Han nationality in Wuhan,and SE may be a useful marker for disease severity and prognosis in the patients with RA.
【Key words】 Arthritis,rheumatoid; Antigenic determinants; HLA-DR antigens; PCR-sequence-specific primers
类风湿关节炎(RA)作为自身免疫性疾病至今病因不明，国内外研究表明，人类白细胞抗原(HLA)DR抗原β链第70～74位氨基酸残基的多态性与RA的易感性有密切的关系，凡是在该段位置上的氨基酸序列为QKRAA、QRRAA或RRRAA的个体，都表现出对RA的易感性增高［1，2］。但不同种族，不同地理环境中，HLA-DRB1基因型的构成差异较大［3］。为探讨这些共同表位(shared epitope, SE)与RA易感性及疾病严重性的相关性，我们对武汉籍汉族的RA患者和健康人群的HLA-DR1和HLA-DR4进行基因分析。
1 资料与方法
1.1 研究对象
78例RA患者均符合美国风湿病协会1987年RA分类标准［4］，男性12例，女性66例，年龄(39±10)岁，病程(10±8)年。另选择健康成年人126名作为正常对照组。所有观察对象均为祖籍三代居住武汉地区，无血缘关系的汉族人。两组对象的年龄和性别构成差异无显著性。
1.2 方法
1.2.1 全血DNA的制备：取外周血3 ml，2% EDAT抗凝，常规盐析法提取DNA。
1.2.2 HLA-DR1和HLA-DR4等位基因及其亚型测定：采用PCR-SSP法，按文献［5］略加改进。引物的核苷酸序列、扩增产物长度及其扩增的特异等位基因分别见表1。以β球蛋白基因作为内对照，5′端引物序列为 5′-TATCATGCCTCTTTGCACCA-TTC-3′，3′端引物为5′-AATGCACTGACCTCCCACATTCC-3′，扩增片段长约580 bp。95 ℃预变性5 min，然后按94 ℃变性25 s，64 ℃退火55 s，72 ℃延伸30 s，循环30次，72 ℃再延伸5 min，扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察。
表1 应用PCR-SSP进行HLA-DRB1*01，
*04亚型分析的特异性引物核苷酸序列、产物长度及扩增特异性
| 5′引物 | 序列(5′-3′) | 3′引物 | 序列(5′-3′) | 产物(bp) | 扩增特异性(DRB1*04) |
| 5′04 | GTTTCTTGGAGCAGGTTAAACA | 3′041 | GTCCACCGCGGCCCGCT | 212 | 01，02，09 |
| 5′04 | GTTTCTTGGAGCAGGTTAAACA | 3′042 | CGCGGCCCGCTCGTCT | 206 | 02 |
| 5′04 | GTTTCTTGGAGCAGGTTAAACA | 3′043 | TGCAGTAGGTGTCCACCT | 222 | 03，06，07，11 |
| 5′04 | GTTTCTTGGAGCAGGTTAAACA | 3′044 | CTGCAGTAGGTGTCCACCG | 223 | 01，02，04，05，08，09，10 |
| 5′04 | GTTTCTTGGAGCAGGTTAAACA | 3′045 | TGTTCCAGTACTCGGCGCT | 171 | 05，09，10，11 |
| 5′04 | GTTTCTTGGAGCAGGTTAAACA | 3′046 | CGCTGTCGAAGCGCACGG | 111 | 06 |
| 5′04 | GTTTCTTGGAGCAGGTTAAACA | 3′047 | CTGCACTGTGAAGCTCTCAC | 260 | 01，05，07，08，09 |
| 5′04 | GTTTCTTGGAGCAGGTTAAACA | 3′048 | CTGCACTGTGAAGCTCTCCA | 260 | 02，03，04，06，10，11 |
| 5′引物 | 序列(5′-3′) | 3′引物 | 序列(5′-3′) | 产物(bp) | 扩增特异性(DRB1*01) |
| 5′01 | TTGTGGCAGCTTAAGTTTGAAT | 3′A | CTGCACTGTGAAGCTCTCAC | 255 | 01，03 |
| 5′01 | TTGTGGCAGCTTAAGTTTGAAT | 3′B | CTGCACTGTGAAGCTCTCCA | 255 | 02 |
| 5′01 | TTGTGGCAGCTTAAGTTTGAAT | 3′C | GGCCCGCCTCTGCTCCA | 195 | 01，02 |
| 5′01 | TTGTGGCAGCTTAAGTTTGAAT | 3′D | CGGCCCGCTCGTCTTCC | 195 | 03 |
| 5′01 | TTGTGGCAGCTTAAGTTTGAAT | 3′E | TCGCCGCTGCACTGTGAAG | 261 | 04 |
1.2.3 临床观察指标：包括患者的发病年龄、性别、病程、关节外表现(血管炎、皮下结节、雷诺现象等)、红细胞沉降率(ESR)、C反应蛋白(CRP)、类风湿因子(RF)、患者受累关节及其放射分数［6］等。
1.3 统计学处理
用χ2检验进行率的比较，两组间差异分析采用t检验。
2 结果
2.1 RA患者和正常对照组共同表位的频率：见表2。RA患者中呈SE阳性的有34例，明显高于对照组(43.6%比15.1%，P＜0.01)，其中编码QKRAA共同表位(DRB1*0401)的有4例(5.1%)，编码QRRAA (DRB1*0101、*0102、*0404、*0405、*0408)有30例(38.5%)。
表2 SE与RA疾病严重性的关系
| 表现型 | RA | 对照 | P值 | RR | ||
| 例数 | % | 例数 | % | |||
| SE | ||||||
| - | 44 | 51.3 | 107 | 84.9 | ||
| ＋ | 34 | 43.6 | 19 | 15.1 | ＜0.01 | 4.35 |
| SE杂合子 | ||||||
| DRB1*01 | 3 | 3.8 | 3 | 2.3 | 1.64 | |
| DRB1*04 | 32 | 41.0 | 16 | 12.7 | ＜0.01 | 4.78 |
| SE纯合子 | ||||||
| DRB1*04 | 3 | 2.4 | 0 | 0 | ＜0.01 | |
RA患者中，呈DR4阳性的有41例(52.5%)，其中编码SE的有32例(41.0%)，对照组中DR4阳性有27例(21.6%)，其中编码SE的有16例(12.7%)，均低于RA患者(P＜0.01)。
2.2 SE阳性和SE阴性的RA患者的临床特征的比较，见表3。编码SE/SE(SE纯合子)和SE/－(SE杂合子)组患者的关节压痛数、放射分数以及类风湿结节数与－/－(SE阴性)组相比有明显差异(P＜0.01)，编码SE/SE和SE/－组相比仅放射分数有差异(P＜0.01)外，余差异无显著性。
表3 SE阳性和SE阴性的RA患者的临床特征比较
| 项目 | ES/SE | SE/－ | －/－ |
| 发病年龄(岁) | 46±11 | 51±14 | 47±13 |
| 类风湿结节数n(%) | 4(100)* | 30(85.7)* | 5(12.5) |
| RF(≥1∶20)n(%) | 3(75) | 28(82.4) | 32(80) |
| ESR(mm/1h) | 52±33 | 57±31 | 50±33 |
| 压痛关节数(个) | 29±13* | 27±12* | 16±11 |
| 肿胀关节数(个) | 21±14 | 20±12 | 15±5 |
| 受限关节数(个) | 12±9 | 11±7 | 10±5 |
| 放射分数(分) | 49±31*Δ | 29±20* | 13±10 |
| 注：与－/－相比，*P＜0.01；与SE/－相比，ΔP＜0.01 | |||
2.3 RA患者关节受累部位与SE的关系：见表4。SE阳性组RA患者总的受累关节数目和放射分数较高，尤其是腕关节、肘关节和膝关节受累频率明显高于SE阴性组(P＜0.01)。而掌指关节、近端指关节、远端指关节、髋关节、肩关节与SE关系不大。
表4 SE与关节侵蚀的关系
| 关节 | SE(－) | SE(＋) |
| 腕关节(个) | 8 | 34* |
| 掌指关节(个) | 30 | 33 |
| 近端指关节(个) | 29 | 30 |
| 远端指关节(个) | 3 | 5 |
| 膝关节(个) | 5 | 30* |
| 肘关节(个) | 2 | 34* |
| 髋关节(个) | 2 | 5 |
| 肩关节(个) | 12 | 15 |
| 注：与SE(－)相比，*P＜0.01 | ||
3 讨论 RA的病因较复杂，除环境因素外，遗传因素也在RA的发生和发展中起着重要的作用。目前已证实RA患者在细胞免疫和体液免疫异常，如患者多伴有IgM-RF、抗ssDNA抗体等自身抗体增高。随着免疫遗传学的发展，已有许多研究证实RA与HLA相关。
HLA复合体位于人类第6号染色体短臂上，其中HLA-II类基因具有高度多态性，是参与机体特异性识别和免疫应答的主要成分。HLA等位基因多态性决定了个体免疫反应的表型，通过对T细胞的自身调节，影响抗原递呈过程。至今已发现与RA有关的基因型有：DRB1*0401、*0404、*0405、*0408、*0101、*0102、*1001、*1402，这些基因编码DR抗原的第三高变区氨基酸序列均为QKRAA或QRRAA或RRRAA(共同表位学说)［7，8］。上述序列中个别氨基酸如果被带相反电荷的氨基酸取代，将降低RA易感风险。Toussirot等发现，法国东部高加索人群RA患者以编码QRRAA为主，基因型主要为DRB1*0401。Nepom等研究显示编码共同表位阳性的RA患者中QKRAA占74%。我们采用PCR-SSP法对武汉籍汉族RA患者进行编码SE的DR基因分析，RA患者SE的阳性率明显高于正常人群，且以QRRAA与RA相关为主，基因型以DRB1*0405为主，结果与我国北方的有关研究相似，表明与RA发病有关的SE有一定的地域差异。
本研究还显示，RA患者编码SE/SE和SE/-患者与关节压痛数、侵蚀性病变(放射分数)、关节外表现(如类风湿结节)有较强相关性，提示编码共同表位的RA患者病情较重，治疗及预后较差。如果将编码共同表位阳性的RA患者受累关节部位与共同表位阴性组相比较，发现共同表位阳性组RA患者的腕关节、肘关节以及膝关节受累的频率高于共同表位阴性组。Moreno等研究认为，西班牙人群中RA患者SE阳性与膝关节、肘关节和肩关节侵蚀有关。
共同表位学说认为这些由不同基因编码的共同表位QRRAA或QKRAA，它们的氨基酸残基恰好位于HLA-Ⅱ类分子抗原结合槽的α螺旋部位，这些氨基酸具有与共同的抗原结合特性，可与致关节炎抗原肽结合，并将其呈递给T细胞，从而导致RA发病。Roudier等发现EB病毒包膜的一种糖白gp110含有与HLA-DRB1中70～74位相同的氨基酸序列，EB病毒感染可能诱发T细胞对gp110的免疫反应，并和DR4发生交叉免疫反应，从而导致RA发病。
RA的临床表现复杂多样，共同表位可作为疾病严重性和预后的参考指标，在RA患者发病早期，可根据共同表位的检测情况采取针对性治疗，以及时控制病情。当然HLA-II类基因在RA发病中的作用仅占33%，说明有共同表位以外的机制在RA发病中起作用，尚需进一步研究。
参 考 文 献
1,Hong C,Park MH,Takeuchi F,et al.Association of specific amino acid sequence of HLA-DR with rheumatoid arthritis in Koreans and its diagnostic value.J Rheumatol,1996,23:1699-1703.
2,Yelamos J,Garcia-Lozano R,Moreno I,et al.Association of HLA-DR4-Dw15(DRB1*0405) and DR10 with rheumatoid arthritis in a Spanish population.Arthritis Rheum,1993,36:811-814.
3,McCuskey CT,Reid B,Green D,et al.HLA-D region antigens in patients with rheumatoid arthritis.Arthritis Rheum,1991,34:192-197.
4,Arnett FC,Edworth S,Blook DA,et al.The american rheumatism association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis.Arthritis Rheum,1987,31:315-324.
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7,Winchester R,Dwyer E,Rose S.The genetic bases of rheumatoid arthritis:the shared epitope hypothesis.Rheum Dis Clin North Am,1992,18:761-783.
8,Gregersen P,Silver J,Windchester R. The shared epitope hypotheses:an approach to understanding the genetics of susceptibility to rheumatoid arthirtis.Arthritis Rheum,1987,30:1205-1213.