e抗原阴性乙型肝炎患者病毒前C区1896点突变的检测

　　一、材料和方法

　　1.病例来源：均来自本院门诊及住院病人，随机取材。

　　2.引物设计：共设计两对引物，第一对用于扩增HBeAg阴性的乙肝患者血清中的HBV DNA，P₁位于1 865到1 889，P₃位于2 410到2 430，扩增片断为566 bp；第二对引物用于检测1 896 G～A点突变是否发生：利用PCR扩增引物3′端碱基必须与模板配对才能进行PCR扩增的原理，在1 876～1 896位设定PCR上游引物P₂，且3′末端设定为突变碱基A，下游引物与P₃通用。而未发生1 896突变的HBV进行PCR扩增不会出现阳性结果，只对1 896 G～A突变病毒进行特异性扩增。P₂、P₃引物PCR扩增片断为552 bp。所有引物由上海细胞生物研究所合成。

　　3.实验方法：酶联免疫吸附测定(ELISA)方法筛选符合实验要求的乙肝患者血清标本(HBeAg阴性)1 017份(试剂由上海科华实业有限公司生产)；P₁、P₃引物对PCR扩增其中的HBV DNA(包括野生株和变异株)；对HBV DNA阳性血清，利用P₂、P₃引物对PCR检测其中的HBV是否有1 896位点突变，同时在RA 1 000型自动生化分析仪上检测血清中的谷氨酰氨基转移酶(ALT)。

　　二、结果

　　1.对1 017例HBeAg阴性的乙肝患者，以P₁、P₂引物进行PCR扩增，扩增出78份HBV DNA阳性，阳性率达7.7%。扩增产物与标准品对照，为566 bp，与预期相符。

　　2.78例HBV DNA阳性血清，同时进行1 896位突变点检测和ALT测定。结果有63例出现了1 896位点突变。占所有待检血清的6.2%，占DNA阳性血清的80.8%(63/78)。在分布上不存在年龄和性别差异。59例血清中ALT＞45IU/L，其中感染HBV变异株血清中56份异常，占88.8%。15例感染野生株且DNA阳性血清中，仅3例ALT异常，占20.0%。ALT指标在2种患者中比较，差异有非常显著意义(P＜0.01)。

　　三、讨论

　　通过上述研究发现，7.7%HBeAg阴性的乙肝患者HBV DNA阳性。由此可见HBeAg阴性不能作为诊治病情的唯一指标。前C区中1 896 G→7A位点突变最重要，因为它使前C区编码第28位色氨酸密码子变成了终止密码子TAG，使病毒不能在肝细胞内合成完整的HBeAg分泌入血清中。在Horikita的研究中，8例抗-HBe阳性病例中6例出现该点突变，而我们所研究的1 017份HBeAg阴性的乙肝患者血清中，63例出现了1 896位点突变，占6.2%，占HBV DNA阳性血清中的80.8%。

　　Omata等研究发现前C区的突变常导致患者病情加重。我们的结果发现，63例变异株感染患者中56例(88.8%)ALT高于正常，而15例DNA阳性野生株感染患者中仅3例(20.0%)ALT异常。