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骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌细胞

来源:www.ccheart.com.cn
摘要:吴炜张抒扬陈连凤袁岩目的:观察5-氮杂胞苷(5-aza)体外诱导分化骨髓间充质干细胞(MesenchymalStemCells,MSCs)成为心肌细胞的作用,并为进一步体内研究而进行细胞标记。方法:提取小型猪骨髓20ml,体外分离培养骨髓间充质干细胞,分为对照组和诱导组,其中诱导组在培养第3天加入5-aza(10ų。诱导组......

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吴炜 张抒扬 陈连凤 袁岩

目的:观察5-氮杂胞苷(5-aza)体外诱导分化骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)成为心肌细胞的作用,并为进一步体内研究而进行细胞标记。
方法:提取小型猪骨髓20ml,体外分离培养骨髓间充质干细胞,分为对照组和诱导组,其中诱导组在培养第3天加入5-aza(10ųmol/L),分别在培养2周和4周时观察两组细胞光镜、电镜下形态,4周时进行磷钨酸-苏木素染色(PTAH)和肌动蛋白(actin)免疫组化染色。诱导组MSCs加入5-溴脱氧尿嘧啶(BrdU,5ųg/ml),分别在作用后第2周和第4周,利用BrdU单克隆抗体免疫组化检测BrdU标记方法。此外,用含有LacZ基因的复制缺陷腺病毒转染诱导组MSCs,利用X-gal染色检测LacZ基因表达的半乳糖苷酶,观察诱导分化后MSCs的体外标记情况。
结果:体外能够成功地分离骨髓MSCs,5-aza诱导分化2周和4周后的MSCs在光镜下明显成为梭形,形态类似肌细胞。电镜下诱导分化后的MSCs在2周时出现肌丝结构,4周时肌丝明显增多。PTAH染色显示超过70%的细胞具有横纹肌的染色性质,actin免疫组化染色显示:超过80%的诱导后MSCs肌动蛋白呈阳性表达。体外BrdU单克隆抗体检测BrdU掺入到MSCs细胞核中,X-gal染色证明LacZ基因能够进入MSCs并表达,两种体外标记方法在标记2周和4周时都为阳性。
结论:5-aza能够诱导骨髓MSCs成为心肌细胞,BrdU掺入和含有LacZ基因的复制缺陷腺病毒转染能够成功地对诱导分化后MSCs进行标记,并且标记持续至少4周。
关键词:干细胞 ,骨髓  5-氮杂胞苷   诱导分化   标记

冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)已成为危及人类健康的头号杀手。目前一般认为,出生以后心肌细胞的增殖能力就停止了,成人的心肌细胞缺乏再生能力,不能够替代坏死组织。在过去的十余年中,基础和临床研究者们开始探索干细胞移植的治疗策略,利用骨骼肌卫星细胞、胚胎干细胞和骨髓干细胞3种干细胞来源进行体内、体外诱导分化和移植,在动物模型和临床试验中获得了初步的成功。本研究的目的是分析5-aza对骨髓间充质干细胞的诱导分化作用,并进行有效的体外标记,作为进一步体内研究的基础,本研究于2003年9-12月进行。

1 材料和方法
材料与分组   骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离和培养:小型猪(北京协和医院动物室提供)髂前上棘骨穿抽取20ml骨髓,通过Nycoprep分离液(购自深圳达科为公司)密度梯度离心(1000r/min)方法将其与红细胞分离,洗涤后用含15%胎牛血清(Hyclon公司)的IMDM(Iscove’s modified Delbecco medium)培养基(Gibco公司)培养[加入青霉素G(100U/mL),链霉素(100ųg/mL)],骨髓MSCs具有贴壁的性质,培养基中悬浮的造血干细胞和红细胞在多次换液和传代后逐渐去除。将培养的MSCs分为对照组和5-aza诱导组,其中诱导组于培养的第3天在培养基中加入5-aza(10 ųmol/L),避光并作用24小时后洗去5-aza,继续传代培养,平均5-7日一代,共培养6周。

光镜和电镜观察  在光学显微镜下观察对照组和诱导组MSCs的形态,并记录2周和4周时的情况。在2周和4周时刮取生长良好的MSCs于小EP管中,离心(800r/min)5min后2.5%戊二醛固定30min,PBS清洗、缓冲、Epon812树脂包埋,进行透射电镜(JEM-1010)观察。
磷钨酸-苏木素染色(PTAH)  在诱导组MSCs培养4周时将细胞接种贴片培养24小时,PBS缓冲液清洗后进行PTAH染色。
诱导后MSCs肌动蛋白鉴定     在诱导组MSCs培养4周将细胞接种贴片培养24小时,无水乙醇固定15min,PBS清洗,选择Ultrasensitive S-P免疫组化染色试剂盒(购自福州迈新生物技术开发公司),联苯二胺(DAB)显色,利用鼠抗平滑肌盒心肌特异性肌动蛋白(actin)抗体(Santa-Cruz)公司进行免疫组化鉴定。
诱导后MSCs体外5-溴脱氧尿嘧啶(BrdU)掺入和检测   在诱导组MSCs培养的第6天,10ml培养基中加入10 ųl BrdU(Sigma公司)溶液(BrdU 50 mg;二甲基亚砜0.8ml;去离子水1.2ml),终浓度为5 ųg/ml,共同孵育24小时。掺入BrdU2周和4周时将细胞接种贴片培养24小时,无水乙醇固定15min,PBS清洗,选择上述显色试剂盒,利用鼠抗 BrdU单克隆抗体(Santa-Cruz公司)进行免疫组化鉴定。
含LacZ基因的复制缺陷腺病毒转染标记和检测   在诱导组MSCs培养的第6天,10ml培养基中加入100ųl含LacZ基因复制缺陷腺病毒裂解液共同孵育转染,继续传代培养,在转染后2周盒4周时用X-gal染色检测MSCs半乳糖苷酶的表达。

2 结果
2.1  光镜和电镜观察结果   体外分离培养的骨髓MSCs在培养基中能够贴壁,与造血干细胞和残余红细胞分离,初始贴壁的MSCs为椭圆形、多角形、不规则形,约5-6天传代一次;5-aza诱导后2周的骨髓MSCs成明显的梭形,具有极性,类似肌细胞形态,约6-7天传代一次。4周后诱导组MSCs机化明显,而对照组细胞则仍为多角形或不规则形。
透射电镜观察结果   诱导分化2周后的骨髓MSCs出现肌丝结构,4周时肌丝结构明显增多,而对照组并未出现肌丝结构。
2.2 磷钨酸-苏木素染色超过70%的诱导组骨髓MSCs经PTAH染色后为蓝色,具有横纹肌细胞的性质,对照组为阴性。
2.3 肌动蛋白鉴定  超过80%的诱导组骨髓MSCs免疫组化染色显示actin阳性,DAB显色为棕色,对照组为阴性结果。
2.4 5-溴脱氧尿嘧啶掺入的检测  诱导组骨髓MSCs在BrdU 掺入2周和4周时免疫组化染色,细胞核染为棕色(DAB),证明BrdU掺入细胞核中,未掺入之诱导组MSCs为阴性结果。
2.5 含LacZ基因的复制缺陷腺病毒转染检测  含LacZ基因的复制缺陷腺病毒转染诱导组骨髓MSCs后2周和4周,X-gal染色显示细胞被染为蓝色,证明细胞表达半乳糖苷酶,未转染细胞染色为阴性。

3 讨论
在冠状动脉硬化斑块的基础上血栓形成、导致急性心肌梗死的发生,是冠心病事件链(猝死、心脏扩大、心力衰竭)过程中最重要的环节。心肌梗死后心肌细胞数量和功能会受到永久性的损伤。自体骨骼肌卫星细胞体外扩增困难,同心肌细胞在形态、电机械耦联和对缺血翻译等基本生物特性上仍然存在明显的区别;胚胎干细胞移植学院免疫抑制,并涉及伦理学问题,而骨髓干细胞具有容易获得自体细胞、无伦理问题、具备多能干细胞性质等多项优点,Makino和Fukuta在1999年提出用5-aza诱导分化MSCs两周后能够形成心肌细胞。但是诱导分化以后的MSCs并不与心肌细胞完全相同,一方面是因为心肌细胞同骨髓机细胞缺乏非常特异的标记物而导致鉴别困难,另一方面是诱导后的心肌细胞电生理表现同骨骼机细胞有类似性,而与正常的心肌细胞存在差异。本研究也证明了5-aza的诱导作用,同时发现,MSCs在体外扩增速度较慢,尤其是5-aza诱导后。因此后续研究在5-aza基础上考虑模拟心肌局部微环境的效应进行了尝试,如添加部分细胞定向分化细胞因子等,已得到了初步的验证,有关研究结果将作进一步的报道。

另外,心肌梗死并不仅仅是心肌细胞坏死,还包括供应心肌的血管损伤,所以同时移植可以分化为心肌、血管内皮和平滑肌细胞的骨髓单个核干细胞群在理论上比单一的心肌细胞移植更好。

透射电镜观察在诱导组MSCs中找到了明显的肌丝,但是并未找到心肌细胞特异性的闰盘结构,结合免疫组化染色,说明诱导后的MSCs具有初步的心肌细胞性质,但是与成熟的、分化完全的成体心肌细胞还是有一定的差异。PTAH染色是横纹肌特异性染色,能够将横纹肌细胞染成蓝色,本研究中的阳性结果证明了诱导后细胞的这一特点,但是HE 染色高倍镜下未能看见横纹结构,说明诱导后细胞内肌丝结构排列还未达到成熟心肌的肌节排列。免疫组化染色选择的actin是平滑肌细胞核心肌细胞特异性,与骨骼下细胞无交叉反应,其阳性结果,结合PTAH染色,证明诱导后的MSCs具有心肌细胞的特性。

本研究是下一步大规模动物实验的前期工作,所以选择的是小型猪骨髓MSCs,为了证明将来移植的骨髓MSCs能够在新部位存活和增殖,需要进一步对体外诱导的MSCs进行标记。良好的标记方法要求不影响细胞,较高的标记效率,细胞在体内增殖后仍然具有良好的标记效果,长期保持标记能力。BrdU作为核苷酸类似物可以在细胞S期进入DNA序列中,标记的是细胞核,本研究中BrdU标记效率达75%以上,同以往的报道相符。含LacZ基因的复制缺陷腺病毒转染MSCs表达半乳糖苷酶,作用于底物X-gal为蓝色。在转染之前需要计算病毒滴度核转染效率,在本研究中,诱导后MSCs的转染效率达到了50%以上。两种标记方法在4周后都维持了良好的标记能力,为进一步动物体内研究建立了良好的基础。

自体骨髓干细胞移植是崭新的心肌细胞修复和血管重建方法,其作用已经在临床工作中展开评价。在关注其有效的同时,我们还需要进一步解决医心几个方面的问题:首先,动物研究以及初步的临床实验显示细胞移植是安全的,但是异源细胞是否会导致严重的心律失常,干细胞的增殖性是否会造成肿瘤的发生,需要我们以极为严谨的态度认真对待。其次,细胞类型选择、诱导分化效果、移植世界和数量以及移植方式需要优化。考虑骨髓单个核细胞共培养技术,能够提高细胞移植的治疗效果和安全性,尤其当陈旧心梗在移植部位心肌微环境已经改变时事先在体外定向诱导成功,可以避免干细胞在体内向成纤维细胞分化。再者,目前对干细胞移植改善心功能的基本机制不清,而这方面的工作有助于我们针对性选择合适的移植时间、细胞数量以及细胞类型,提高细胞移植效果。最后,目前的研究多涉及急性心肌梗死,而且缺乏长期观察。骨髓干细胞移植能否对陈旧性心肌梗死有效,治疗后远期死亡率十分下降,都需要我们在将来的工作中进一步研究。

作者: 2007-7-10
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