慢性肾衰啮齿类诱导模型的研究进展

  2007年肾脏疾病改善全球成果(Kidney DiseaseImproving Global Outcomes，KDIGO)定义慢性肾脏疾病(chronic kidney disease，CKD)是一种进行性肾损伤，肾小球滤过率(glomerular filtration rate，GFR)大幅下降，GFR<60 ml／min／1．73 n12持续3个月以上，肾功能逐渐丧失[1-2]。对于CKD的定义，有学者提出应考虑其他诊断指标，以及其他疾病如心血管疾病的影响，增加CKD诊断分级[3-43。CKD最终导致终末期肾衰竭(end-stage renal disease，ESRD)，患者必须接受透析、肾移植等治疗；而且显著增加心血管疾病风险、病死率；CKD已成为全球公共健康问题，严重影响着人类的健康[5-6]。动物模型以及临床研究证实，CKD主要症状是GFR显著下降、蛋白尿、血肌酐上升、血尿素上升等；一肾小球硬化、肾小管间质纤维化、管周毛细血管稀薄是慢性肾病的主要病理标志  。根据病因、研究目的，动物模型主要分为手术诱导模型、化学诱导模型、物理诱导模型、自发模型、遗传工程模型、免疫诱导模型等。这些模型只是对CKD疾病某些方面的模拟，从一定程度上反映CKD的发展过程，因此需要根据不同的研究目的进行选择 。本文仅对应用广泛、易于实现的手术诱导型、化学诱导模型以及在中药药理研究中应用的模型进行综述，以供参考。
1手术诱导模型
  手术诱导模型是指通过手术的方式改变实验动物原有的正常生理结构，导致肾损伤，从而模拟CKD的发展过程。这类模型主要包括单侧尿道梗阻模型、残肾模型等。
1．1单侧尿道梗阻(unilateral ureter obstruction，UUO)模型：从腹中线开腹或中线左侧开腹，暴露左侧输尿管，在肾盂下与左肾下边缘平行，分两点结扎输尿管；1～2周后肾小管间质纤维化明显。该模型大鼠、小鼠都可应用，术式基本相同[8-11]。另外有学者研发了UUO缓解(UUO-release。UUO-R)模型：即不结扎梗塞输尿管，而是用金属微型夹夹闭，关腹；然后按实验设计时间点重新开腹，去除夹子，解除输尿管梗塞  。UUO模型在肾小管间质纤维化研究中得到广泛应用，该模型肾小管纤维化病理变化明显、稳定，大鼠、小鼠均可应用。
1．2残肾模型：①5／6肾切除(动脉结扎)模型：雄性Wister大鼠，背部左肾区切开，去除肾膜，暴露左肾动脉，用电凝器切断2／3肾动脉；两周后切除右肾。10周后大鼠CKD症状明显：血浆肌酐增高3倍、血浆尿素增高4倍、肌酐清除率降至40％、收缩压增高45％、舒张压增高30％、心律增高15％。这一类模型有的术式有些变化，但大体相近，如腹中线开腹、手术缝合线结扎动脉、动脉结扎与右肾切除同日操作、或一周后切除右肾等。手术后4～8周，出现肾小球硬化、高血压[14-15]。5／6肾切除模型的主要特点是动脉高压、蛋白尿、肾小球化；该模型与临床CKD相似，是研究CKD及并发高血压(心血管疾病)的主要动物模型。②5／6 肾 切除(部分切除)模型：术式与5／6肾切除模型相同，只是不结扎左肾动脉，而是切除左肾上下极，肾切除总质量接近5／6。该模型没有明显高血压症状，肾小球损伤不如结扎术式严重，一般10周以上病理症状才较明显 。该模型血压接近正常值，是研究非高血压CKD的模型，缺点是成模时间较长。③小鼠5／6肾切除模型：术式基本与大鼠相同，第4～12周出现CKD症状，但存在品系差异，C57BL耐受，CD-1、129S3易感[19-20]。由于小鼠自身的品系资源优势、成本优势，小鼠5／6肾切除模型应用逐渐增多；缺点是手术操作不便，品系间存在耐受，结果不一致。
2化学诱导模型
    化学诱导模型是指通过各种化学物质(或药物)影响动物代谢，或直接造成肾脏组织损伤，从而模拟CKD的发展过程。主要有链脲佐菌素(STZ)诱导糖尿病模型、激素诱导模型、药物肾毒性模型等。
2．1 STZ诱导糖尿病肾病(diabetickidneydisease，DKD)模型：C57BL／6、CD-1单次腹腔注射STZ 200 mg／kg；129Sv腹腔注射STZ 50mg／kg，连续5 d。结果，CD．1、C57BL／6、129Sv均表现为高血糖(>500 mg／d1)、蛋白尿，其中CD．1肾小球损伤明显重于C57BL／6、129Sv；6个月后CD．1肾小管纤维化明显，而C57BL／6、129Sv在死亡前并未出现肾小管纤维化  。STZ诱导DKD的成模标准：①全期GFR下降超过50％；②蛋白尿增高10倍；⑧病理特征：肾小球系膜浸润、结节状坏死、溶解；④肾小球基膜变薄超过50％；⑤肾小管纤维化  。STZ低剂量(40~65 mg／kg)诱导DKD模型，大鼠易感、小鼠耐受；STZ大剂量(100~200 mg／kg)诱导DKD模型，一般采用单次注射，对易感品系多采用低剂量重复注射，一般4～8周就出现DKD症状  。该模型是主要的诱导DKD模型，操作容易；缺点是成模率不稳定，需要严格筛选，小鼠品系间存在耐受。
2．2醋酸脱氧皮质酮(DOCA，醋酸脱氧皮质酮)诱导模型：Wister大鼠背部切口，左肾切除，皮下植入25 mg DOCA药片，口饲1％盐水。6周后出现高血压、肾小管纤维化、毛细血管萎缩、肾小球硬化等CKD症状  。SD大鼠，切除左肾，皮下植入75 mg DOCA缓释药片，口饲1％盐水，5周后SD大鼠出现肾小球硬化、蛋白尿、高血压等CKD症状；WF大鼠表现耐受  。该模型诱
导低肾素高血压，与临床醛固酮超负荷CKD相似；该模型稳定，容易操作，也可用于小鼠。
2．3  肾毒性诱导模型：①环胞霉素A诱导模型：大鼠7．5 mg／kg•d～、15 mg／kg•d 皮下注射28 d；或20 mg／kg•d_1灌胃28 d。小鼠25 mg／kg•d1腹腔注射35 d。病理表现为肾小球硬化、肾小管间质纤维化、小管坏死  。环胞霉素A是用于器官移植的免疫抑制剂，该模型主要应用于CI(D的间质纤维化、肾小球硬化以及环胞霉素A肾毒理研究，肾损伤程度依赖于环胞霉素A剂量  。②腺嘌呤诱导模型：2％腺嘌呤溶液200mg／kg灌胃，1次／d，2周后按100mg／kg灌胃，隔日1次，灌胃1周。病理表现为蛋白尿、肾小球硬化、肾小管间质纤维化、肾小管萎缩、肾脏皮质广泛沉积结晶  。10％腺嘌呤溶液600 mg／kg d一。连续灌胃10 d   。实验动物以大鼠为主，该模型的缺点是体重下降快、死亡率高、腺嘌呤毒性广泛，其他器官毒性不明确；优点是操作方便，CKD症状明显。国外文献中，腺嘌呤诱导模型主要用于研究CKD血管钙化综合症；国内以CKD的肾损伤研究为主。③阿霉素诱导模型：雄性SD大鼠，120~180 g，阿霉素5 mg／kg静脉注射；模型组死亡率为20％。7 d后尿蛋白、胆固醇增高2倍以上，肾脏未见明显病理改变L29J。雄性SD大鼠320~350 g，2 mg／kg静脉注射；6周后尿蛋白增高5倍以上，灶性肾小球肾炎明显L30J。雄性SD大鼠，280~300 g，阿霉素7．5mg／kg静脉注射，左肾动脉夹闭8 mill，死亡率低于25％；6周后出现蛋白尿、右肾小球硬化、右肾小管纤维化显著  。雄性BALB／c小鼠20~25 g，阿霉素10～ll mg／kg静脉注射；6周后尿蛋白增高，肾小球硬化显著；而C57BL／6J耐受  。该模型以大鼠为主，缺点是体重下降、存在死亡率；优点是操作方便，蛋白尿、肾小球硬化症状明显。肾毒性CKD模型丰富，不同诱导物质的肾毒性靶点位置也不相同，可以根据研究的需要参考相关文献选择。
3模型在中药研究中的应用
    《内经》认为，“肾者水脏，主津液”，与脾的运化、肺的宣发肃降密切相关，五脏六腑皆可受累。临床多用大黄、枝子、黄芪、黄连温胆汤、桂枝茯苓丸等中药单方、复方治疗肾脏疾病，但药理机制还不清楚。因此，慢性肾衰诱导模型在中药药理研究中有重要意义。周培等应用腺嘌呤诱导大鼠肾衰模型，证实化浊解毒汤可明显降低血肌酐、尿素氮水平，减少自由基，缓解肾组织纤维化改变，‘抑制慢性肾衰的发展  。利用大鼠残肾模型进行研究，参芪方可抑制肾小球系膜细胞和肾间质成纤维细胞增殖，这可能是参芪方治疗慢性肾衰的机制。阮君山应用大鼠UUO模型，研究TGF[31、CTGF蛋白的表达情况。结果表明，解毒复肾逐瘀方可减轻肾间质纤维化的损伤，可能与抑制大鼠TGF~I、CTGF蛋白表达有关。元敏等应用单肾切除、阿霉素组合技术诱导慢性肾衰模型，研究尿毒清对慢性肾功能衰竭大鼠肾脏纤维化的影响。结果，尿毒清可减少蛋白尿的排泄，改善肾功能，抑制肾小管上皮细胞表型转化，延缓肾脏纤维化。总之，慢性肾衰啮齿类诱导模型是筛选治疗慢性肾病药物、研究中药药理药效机制的重要工具。
4结语
    残肾模型直接导致肾单位大量减少、残余肾单位高负荷工作、合并高血压(或非高血压)，这些特点与临床上肾切除、CKD高血压综合征、孤肾等患者的症状相似，病理变化以肾小球硬化、小管纤维化为主，是研究CKD的良好模型。但对手术技术要求较高，模型复制有一定难度。腺嘌呤诱导模型、STZ诱导DKD、DOCA／NaCL诱导模型直接破坏动物的正常代谢或组织结构，出现肾结石、糖尿病肾病、高血压、动脉钙化、心脏纤维化等，与CKD症状相似，这些模型是研究CKD代谢综合症的重要模型。肾毒性模型的特点是直接损害肾组织，如足细胞损伤，小管损伤，肾小球损伤等，研究者可根据研究目的灵活选择。UUO模型制作时间短，结果稳定，在研究小管纤维化研究中的得到广泛认可，但其致病机制是尿道梗阻，不是临床主要病因，发病率较低；该模型主要应用于肾脏纤维化分子机制的研究。
    CKD模型多数是以大鼠为主，这可能与小鼠操作不便、成模率低、小鼠品系间存在CKD耐受等有关。目前有学者将残肾模型与诱导模型结合，小鼠肾切除与DOCA、高盐、高糖、缺血再灌注、肾毒性等造模方法组合，开发新型小鼠CKD模型E38]。开发小鼠CKD模型已成为发展趋势，利用小鼠的基因组研究优势，可使研究者从基因水平了解CKD的发病机制，深入了解CKD的病理生理过程、分子机制。