骨髓干细胞动员对缺血性脑卒中血管新生的影响

    脑血管疾病(cerebrovascular disease，CVD)作为神经系统的常见病及多发病，是当前导致人类死亡的三大主要疾病之一，并且存活者中有50％一70％的致残率，给家庭和社会带来了沉重的负担。而缺血性脑卒中是CVD的最常见类型，约占全部CVD的70％脑血管闭塞以后，缺血区微血管增生，其增生的范围和程度直接关系到缺血半暗带血流的改善，影响神经元生理功能的恢复。近年来，随着治疗性血管新生方法的出现，采用生物学技术动员骨髓干细胞(bone mar—row stem cells，BMSCs)迁移至损伤的脑组织，进而促进毛细血管新生，改善血流灌注，修复损伤脑组织，减少致残率已成为脑血管病研究领域的热点。本文就骨髓干细胞动员对缺血性脑卒中血管新生的影响的研究现状作一综述。
    骨髓干细胞的分类及特性
    BMSCs是一种多潜能干细胞，具有自我更新和谱系定向分化能力，在不同的诱导条件下可以向各种组织分化。目前认为，BMSCs至少含造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSCs)，间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)和内皮祖细胞(endothelial precursor cells，EPCs)3个细胞群。
1造血干细胞
    造血干细胞(HSCs)为造血前体细胞，主要功能是启动造血并分化形成所有谱系的血液细胞，通常用于治疗造血系统疾病。Hess等_4j研究显示造血干细胞亦可分化为神经小胶质细胞等多种神经细胞，促进脑微循环及神经功能的恢复，进而可改善脑血管病的预后。CD34为其公认的细胞表面标记，可以以此对其进行检测和定位。
2间充质干细胞
    间充质干细胞(MSCs)又称为骨髓基质细胞，因其具有取材容易，来源丰富的特点，是目前使用最为广泛的干细胞。它具有跨胚层分化的能力，能向神经细胞及神经胶质细胞分化，以及分泌多种生长因子及神经营养因子；骨髓间充质干细胞还可以分化为血管内皮细胞，参与缺血组织血管新生和损伤动脉再内皮化，增强血管内皮生长因子(vas—cular endothelial growth factor，VEGF)、血管生成素等的活性以促进血管再生。脑缺血损伤后骨髓间充质干细胞具有减少梗死面积，促进血管发生和神经功能改善的能力。目前尚未发现其特异性的细胞表面标记。
3内皮祖细胞
    内皮祖细胞(EPCs)是血管内皮细胞的前体细胞，不仅参与胚胎血管的生成，还参与了出生后的血管再生和受损内皮的修复过程，能特异性归巢于血管新生组织并分化为内皮细胞。EPCs在特定条件下可分化为血管平滑肌细胞，可替代凋亡或坏死的内皮细胞，从而保留内皮功能，修复受损内皮层，参与重症缺血区血管的形成 。EPCs和HSCs来源于共同的成血管细胞，表达共同的细胞表面抗原，如Flk21／KDR、Tie22和CD34等。
    骨髓干细胞动员及其影响因素
1  骨髓干细胞动员的过程与环节
    骨髓干细胞动员，指骨髓释放其干细胞到外周血的现象。广义上讲，指通过机体本身的代偿机制即内源性动员以及外界人为因素干预，促使BMSCs迁移到骨髓外，以增加循环血液中干细胞的数量。狭义上，则主要指通过使用动员剂进行干预促使BMSCs释放到外周血。目前认为骨髓干细胞动员治疗缺血性脑损伤的过程包括动员、归巢和分化3个环节。①动员：干细胞动员剂通过改变BMSCs与骨髓基质间的相互作用，这一阶段涉及一系列细胞黏附分子和趋化因子、生长因子等的相互调节反应，影响干细胞的黏附、迁移和定居特性，使干细胞穿过基质膜和血管内皮层进入循环血流中，致外周血中的干细胞数增加。②归巢：即动员后的干细胞向缺血区定向迁移。归巢干细胞的数量很可能决定缺血区组织修复的程度。一般认为，BMSCs抵达靶器官发挥修复作用需要两个必备条件：新近靶器官受损；循环骨髓干细胞数量足够多。另外，Schluter等  认为动员剂粒细胞集落刺激因子(granu．10cyte—colony stimulating factor，G—CSF)在干细胞的归巢过程中亦发挥着重要的作用。但目前干细胞向缺血损伤组织归巢更为确切的机制尚待阐明。③分化：“环境诱导分化”观点认为，缺血损伤区的微环境为决定干细胞分化的关键因素。BMSCs分化潜能好，一定条件下能跨胚层分化为神经组织及神经细胞。
2影响骨髓干细胞动员的因素
    生理条件下干细胞处于静息状态，当机体内环境发生改变，如缺血缺氧、外伤、应激、内毒素、剧烈运动等因素可使骨髓释放干细胞至外周血，增加外周血干细胞数量，即“内源
性”BMSCs动员。动员的BMSCs可以感知靶器官的损害，自动迁移到损伤区域增殖分化，促进血管新生，修复受损器官的结构和功能。同时，缺血、缺氧、炎症、组织坏死等病理性反应促使实质细胞和炎症细胞合成并释放VEGF、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)等促血管因子，动员并趋化BMSCs；研究发现，脑缺血损伤局部VEGF、bFGF表达增加，对干细胞归巢可能起到相应的调节作用，从而增强缺血局部的神经和血管新生，但是这种内源性动员作用较弱。干细胞动员剂，能有效地动员BMSCs，同时某些动员剂能作用于促血管生长因子，促进血管新生。目前所使用的动员剂主要有粒细胞集落刺激因子(G—CSF)、粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子granulo—cyte—macrophage—colonys—timula—tingfactor，GM—CSF)、白细胞介素(interleukin，IL)一27、IL一3、IL—12、干细胞因子、血管内皮生长因子(VEGF)和某些化疗药物，如环磷酰胺等。其中G—CSF、GM—CSF最常用，他们具有动员骨髓间充质干细胞、骨髓造血干细胞和内皮祖细胞的能力。G—CSF作为骨髓干细胞的动员剂，能够促进缺血后干细胞的动员和归巢于脑。GM—CSF能诱导大脑低灌注模型大鼠血管新生。另外，某些药物对骨髓干细胞动员也有一定影响。他汀类药物能增加骨髓动员及外周循环中EPCs的数量、迁移和增殖，并在体外实验中能促进血管的新生及再生。中成药通心络胶囊使外周血EPCs的数量增加、增殖迁移黏附等功能有明显改善。  
    骨髓干细胞动员对缺血性脑卒中血管新生的影响
l  骨髓干细胞动员对缺血性脑卒中血管新生的促进作用
    血管新生是指在原有血管基础上通过血管内皮细胞增殖、游走、芽生，血管分裂、分支而形成新的毛细血管网，使其功能与局部的需要相适应的生物学过程。血管新生与HSCs、EPCs、其他成血管细胞以及多种生长因子高度相关。应用G—CSF动员BMSCs，可使骨髓中包括EPCs在内的多种干细胞成分归巢于梗死灶，参与血管新生。张子强等应用G—CSF进行动员自体骨髓干细胞促进大鼠急性脑缺血损伤后血管新生的实验研究，结果证实动员组缺血坏死区新生毛细血管数目明显多于非动员组。Shyu等研究发现，大鼠脑梗死时，动员BMSCs到外周血，并迁移到脑组织，促进了损伤区血管新生，缩小梗死体积，改善神经功能。同时BMSCs可以合成、分泌多种细胞因子，如VEGF，干细胞因子，G—CSF，内皮型一氧化氮合酶，基质细胞衍生因子等，这些细胞因子促进了EPCs迁移、分化和血管新生。HSCs与血管新生密切相关，并参与血管新生过程。HSCs以旁分泌或自分泌形式分泌血管生成素I(Ang I)，并以剂量依赖方式促进内皮细胞迁移，且诱导内皮细胞朝着产生Ang I的方向移动，同时有助于EPCs植入组织中，启动和促进血管新生。  
2骨髓干细胞动员促进血管新生的机制研究
    骨髓干细胞动员可以促进缺血性脑卒中大鼠血管新生，其可能机制：①骨髓中包括EPCs在内的多种干细胞成分被动员、归巢到脑缺血区，缺血环境使EPCs分化为内皮细胞，引起血管新生。张子强等认为，自体骨髓干细胞动员促进大鼠脑组织缺血区血管新生的机制应该是部分动员的EPCs归巢到脑缺血区并分化形成新生血管。②上调促血管生长因子的表达，持续稳定地促进血管新生。生理状态下，机体内血管一经生成即保持高度的稳定性，受到许多具有正、负向调节性质的关键分子即促血管生长因子和抑血管生长因子的调控，使血管的生长与退缩维持在动态的平衡状态。促血管生长因子包括VEGF、(bFGF)、血小板源性生长因子、表皮生长因子、转化生长因子(TGF)、肿瘤坏死因子等。孙洪波等研究发现使用G—CSF动员BMSCs后，脑梗死患者血浆HGF、VEGF及TGF—B1水平显著增加。葛朝莉等[20j证实应用G—CSF动员自体BMSCs治疗大脑中动脉缺血／再灌注模型大鼠，可增加脑缺血后梗死边缘区bFGF的表达和改善神经功能。
3应用骨髓干细胞动员治疗缺血性脑卒中的实验研究
    随着骨髓干细胞动员促进缺血损伤血管新生基础研究的兴起，国内应用BMSCs动员治疗缺血性脑卒中的实验研究已逐步开展，临床研究尚不多见。多项实验证实，动员BMSCs治疗脑缺血大鼠能促进血管新生、缩小梗死体积、改善神经功能、提高生存率。肖广正等采用G—CSF动员BM—SCs，观察急性脑梗死大鼠脑组织坏死体积及病理变化，发现治疗组大鼠脑梗死灶体积、梗死灶体积占全脑体积百分比明显低于对照组，对照组大鼠脑组织梗死灶周围可见较多的单核细胞和淋巴细胞浸润，而治疗组大鼠部分梗死灶周围被新生毛细血管和神经胶质细胞增生修复，炎性细胞浸润不明显。李建生等发现G—CSF联合脑脉通动员BMSCs可使BM•SCs归巢脑组织的峰值时间延长，并可减轻脑缺血引起的病理损伤和改善神经功能缺损、减轻脑水肿、减小梗死面积。张圣旭等采用外科手术(脑缺血24 h后行去骨瓣减压+颞
肌贴术)联合自体BMSCs动员治疗脑梗死大鼠，结果实验组大鼠的神经功能缺损评分、缺血坏死面积和细胞凋亡数明显低于对照组，坏死脑组织内5一溴脱氧尿嘧啶核苷、脑源性神经生长因子阳性细胞数及微血管数明显多于对照组，说明外科手术联合自体BMSCs动员可促进神经的再生修复和血管的生成、抗细胞凋亡和减少脑梗死面积，进而恢复脑神经的功能。
    针灸与缺血性脑卒中后的血管新生
    针灸作为治疗缺血性脑卒中的一种重要的、行之有效的方法被广泛应用于临床，其作用机制也是广大科研工作者研究的热点。近年来，随着治疗性血管生成研究的兴起，对于针灸在脑缺血后血管新生方面的作用已开展较多研究。研究表明针灸能使脑梗死大鼠缺血区微血管数明显增多。张慧敏等通过检测脑缺血后治疗1、3、5、lOd因子Ⅷ相关抗原(FVSR：A)的表达，表明头针治疗能够有效促进脑缺血状态下海马CA3区脑微血管的新生，并且具有明显的累加蓄积效应。万赛英等发现电针百会、大椎可使易脑卒中型肾血管性高血压大鼠(RHRSP)行为学评分明显改善，超微结构显示，电针组各时间点脑组织神经细胞与血管内皮细胞的损伤较模型组减轻，缺血区微血管密度较模型组增加。
    而在探究针刺促进血管新生的机制研究中，大多数研究从血管内皮生长因子(VEGF)角度探讨针刺促进脑血管新生的机制，研究结果显示，VEGF表达上调是针刺促进脑缺血后血管新生的机制之一。王春霞等发现采用头穴丛刺慢性脑缺血大鼠，其逃避潜伏期明显延长，并检测到其脑内VEGF蛋白表达增高。潘江等采用酶联免疫吸附法和免疫组化法检测大脑中动脉梗阻大鼠脑内、血清中VEGF的表达，发现电针大鼠心包经能明显上调VEGF的含量及表达以及促进微血管的形成。周次利等通过电针局灶性脑缺血再灌注大鼠的百会、水沟、足三里穴，发现电针可增强脑缺血大鼠脑内VEGF的表达，降低内皮抑素的表达，可能为针刺促进脑梗塞大鼠缺血区血管新生的机制之一。马璟曦等通过电针局灶性脑缺血再灌注模型大鼠的双侧合谷穴，观察到电针组VEGF mRNA、Ang一1蛋白比模型组增加明显。而En—dosta．tin蛋白表达增加较模型组明显下降，说明电针可能通过上调血管生长因子和下调血管抑制因子的表达来促进局灶脑缺血再灌注后的血管新生。王频等研究发现艾灸后大鼠海马内表达VEGF、bFGF、bFGF—r的灰度值上调，促进了要害部位的血管新生。
    结语与展望
    综上所述，骨髓干细胞动员能够促进缺血性脑卒中后血管新生，进而减少脑损伤和促进神经功能恢复，作为一种新的治疗手段具有巨大的潜力。但是，基础研究有待进一步明确骨髓干细胞动员向脑缺血组织归巢及分化的确切机制，从而研制出新型的细胞因子药物以提高骨髓干细胞动员治疗的靶向性和高效性。目前研究多采用G—CSF动员BMSCs，但是采用G—CSF作为动员剂仍然存在一些问题，如尚未明确诱导剂的最佳有效剂量及动员的最佳时机；长期应用的安全性，是否会导致其他部位组织内血管增生，是否会促进潜在肿瘤的生长和转移等。临床研究应用MSCs移植治疗脑梗死的较多，而采用骨髓干细胞动员的方法尚不多见。
    目前已有大量研究结果证明针刺可以促进脑缺血损伤部位的血管新生，可以推断血管新生是针刺治疗脑缺血机制中的一个重要途径。针刺可以上调VEGF、bFGF等与血管新生相关的细胞因子的表达，并增强其活性。而这些因子都与参与血管新生的骨髓干细胞的动员有着密切的联系。骨髓干细胞在血管新生中的重要作用以及针刺在促进脑缺血血管新生中的疗效，使大家对针刺治疗脑缺血的机制有了新的思考，目前已有研究说明电针能促进脑缺血大鼠外周血及骨髓EPCs的数量，但尚有待进一步研究说明。