超速离心-高效液相色谱测定血清高密度脂蛋白
和低密度脂蛋白胆固醇：一种候选参考方法
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董军 国汉邦 陈文祥
卫生部老年医学研究所
HDL-C降低 和LDL-C升高，是明确的心血管病独立危险因素
心血管病防治工作需要准确的HDL-C和LDL-C测定结果
建立和保证HDL-C和LDL-C常规测定结果的准确性需要 可靠的参考方法
HDL-C 和LDL-C准确测定 必要性
美国疾病控制与预防中心(CDC) ?定量法
D=1.006 超速离心分离极低密度脂蛋白（VLDL），
制备底部组分（BF）( 包括IDL, LDL, HDL和Lp(a)等）
用肝素-锰离子试剂沉淀BF中的?脂蛋白，制备HDL组分
分别用AK胆固醇参考方法测定BF 胆固醇(BFC)和HDLC，
自BFC中减去HDLC得LDL-C (包括IDL和Lp(a))
样品量大(5 mL)，其应用受到可得样品量限制
LDL和HDL的分离采用化学沉淀法，影响因素较多
样品制备需多部手工容量操作，费时，技术要求高
受超速离心转头品种的限制，每次分析最多18 个样品
由于脂蛋白的不稳定性，样品制备过程（约需24-28小时）
本身造成HDL-C和LDL-C的变化
?-定量法存在的问题
血清脂蛋白胆固醇的体外再分布
超速离心法: 各类脂蛋白的定义方法，在分析化学上可能
也是最可靠的脂蛋白分离方法，是一种物理分离方法，
影响因素最少。
电泳法: 很难用于精密脂蛋白分析。
沉淀法: 沉淀剂和沉淀条件多种多样，影响因素多，
较难实现一致的特异性。
脂蛋白的分离方法
超速离心中的定量操作困难、繁琐，样品量大
部分Lp(a)在HDL密度范围内，造成HDL测定偏差
超速离心法（结合精密胆固醇分析） 参考方法
血清脂蛋白的密度分布
LDL
HDL
VLDL
Lp(a)
Lp(a)是二硫键连接的LDL-apo(a)复和体，还原剂
可使Lp(a)解离为LDL[Lp(a-)]和apo(a).
Lp(a-)密度与LDL相近，或略小于LDL.
若能建立条件，使Lp(a)解离，又不改变HDL的密度
性质，则可实现HDL的超速离心分离.
Lp(a) LDL-apo(a)复合体
不同密度下ME对超速离心BFC的影响
ME对血清脂蛋白密度的影响
样品溶液中ME浓度对1.063密度下超速离心BFC的影响
取来自不同个体的血清49 份
在1.063背景密度及ME（0.05 mol/L）存在和不存在下 超速离心，测定BFC（BFC1.063ME(+)和BFC1.063ME(-)）
用免疫比浊法测定Lp(a)质量
用DCM测定HDLC（HDLCDCM）
ME 解离Lp(a) 有效性
BFC1.063ME(-)与BFC1.063ME(+)之差与Lp(a)的关系
(r=0.848)
BFC1.063ME(-)与BFC1.063ME(+)之差与HDLC的关系 ( r=0.093,)
BFC1.063ME(+)与 HDLCDCM之差与Lp(a)的关系
（r = 0.414, P<0.005）
Lp(a)可与 ?脂蛋白发生非共价键结合
此种结合不能被超速离心完全解离
脯氨酸可以消除Lp(a)与其他脂蛋白的非共价结合
在d =1.150背景密度下试验脯氨酸的作用:
在ME存在下，无脯氨酸时约10％的Lp(a)免疫原性分布在顶部
在ME存在下，含脯氨酸时顶部组分中无Lp(a)免疫原 性
提示血清经ME作用后，部分游离apo(a)仍与某些脂蛋白以
非二硫键形式结合，这种结合可被脯氨酸解离
脯氨酸可以解离Lp(a)与其他脂蛋白的非共价键结合
脯氨酸存在下BFC1.063ME(+)与 HDLCDCM之差与Lp(a)的关系
（r = -0.232, P>0.05）
用ME使 Lp(a) 解离为游离apo(a)和Lp(a)[Lp(a-)]
用脯氨酸解离Lp(a)或apo(a)与脂蛋白的可能非共价键结合
1.063密度下超速离心，将HDL（BF1.063）与其他脂蛋白分离
1.006密度下超速离心，将HDL和LDL（BF1.006）与VLDL分离
用HPLC测定BFC1.006和BFC1.063
HDLC = BFC1.063
LDLC = BFC1.006 - BFC1.063 (含IDLC和Lp(a)C)
方法原理
超速离心密度液配制:
密度液I: 含0.1M脯氨酸的溴化钠溶液，使密度为1.006
密度液II: 含0.1脯氨酸和0.05M ME的溴化钠溶液，调节溴
化钠浓度，使密度为1.0666
(两种密度液（0.8 ml）与血清（0.05 ml）混合
后分别给出背景密度1.006 g/ml和1.063 g/ml)
标准溶液和内标溶液配制:
胆固醇乙醇溶液: 浓度 0.646, 1.293, 2.586 , 5.172 , 7.758 mmol/L
豆甾醇乙醇溶液: 浓度5.17 mmol/L，作内标溶液
密度液及标准溶液配制
样品制备:
用稀释器的稀释功能加入血清样品(体积为0.05ml)和
稀释剂（密度液, 体积为0.8 ml)
超速离心条件: 20℃, 23000 rpm, 离心18.5 h
离心管切割:
用离心管切割器在离心管中液体的中间位置切割离心管，取下部 离心管，内含1.006 g/ml背景密度下的BF（BF1.006）和1.063 g/ml 背景密度及ME存在下的BF（BF1.063），进行胆固醇分析
HDLC = BFC1.063
LDLC = BFC1.006 - BFC1.063
超速离心分离脂蛋白组分
高效液相色谱测定胆固醇 I
将内含不同BF的下部离心管，置10-ml具盖试管中
标准溶液0.05 ml，用0.5 ml乙醇冲入10-ml具盖试管中
向各试管中加乙醇-8.9 mol/L氢氧化钾（9:1）4 ml
各管加内标0.05 ml，用0.5 ml乙醇冲入10-ml具盖试管中
水平式振荡器振荡20 min
50 ℃水解2h
高效液相色谱测定胆固醇 II
400ul Acetone
20μl, 4MH2SO4-4MCrO3
vortex, RT 5min
0.5ml Hexane,
0.5ml water
Vortex, 5min
200ul supernatant dry down for chromatography
0.5ml 水解液
0.5mlH2O, 1mlHexane
Vortex, 20min
0.5ml,Hexane, 挥干
高效液相色谱分离胆固醇和6-氯豆甾醇
超速离心法HDLC(BFC1.063ME(+))与 HDLC DCM的关系
(r = 0.998)
血清 平均值 (mmol/L) 平均批内CV(%) &nb